规模化猪场仔猪源大肠杆菌分离培养及血清型鉴定

马长宾，陈文武，崔　蕾，韩猛立，黄　新，钟发刚

（1.新疆生产建设兵团第六师五家渠市畜牧兽医工作站，新疆 五家渠 831300；2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆 石河子 831000）

规模化猪场仔猪源大肠杆菌分离培养及血清型鉴定

马长宾1，陈文武1，崔蕾1，韩猛立2，黄新2，钟发刚2

（1.新疆生产建设兵团第六师五家渠市畜牧兽医工作站，新疆 五家渠 831300；2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆 石河子 831000）

猪源大肠杆菌易引起仔猪消化道传染病，主要危害1月龄以内的仔猪，常发生严重的腹泻和败血症。常见的有仔猪黄痢、仔猪白痢、仔猪水肿病，具有流行面广、发病率和死亡率高等特点，严重制约养猪业发展。随着大肠杆菌对常用抗生素抗药性越来越严重，应用疫苗预防和控制仔猪腹泻疾病越来越重要，国内外已开展了预防肠毒源性大肠杆菌（ETEC）腹泻的各种类型疫苗研究，例如基因工程活菌苗［1-3］与多价灭活菌苗［4］等。但由于大肠杆菌血清型多，变异大，抗原复杂，制苗菌株的血清型很难与地方菌相一致，影响了菌苗的使用效果。国内外研究资料表明，引起仔猪黄白痢的致病性大肠杆菌常见的O血清型有O4，O8，O9，O45，O101，O115，O138，O139，O147，O199，O157，此外还有O2，O3，O20，O44，O55，O141，O6等血清型。我国学者相继报道了各省的流行血清型［5-10］。但是有关第六师五家渠市地区仔猪源大肠杆菌血清型方面的研究较少。鉴于此，对六师五家渠市规模猪场仔猪大肠杆菌病的血清型流行情况及其优势血清型分布情况进行研究，以便为该病的防控提供理论依据。

1　材料与方法

1.1病料来源根据新疆生产建设兵团第六师、五家渠市养猪业分布的特点，2013年3月-2014年12月期间，分别在101团、103团、新湖农场、芳草湖农场等地，通过科学的选点，用灭菌棉拭子从直肠取样，濒死或死亡的仔猪直接取十二指肠内容物或病变组织，先后共采集疑似仔猪黄白痢、仔猪水肿病料361份。

1.2培养基及试剂麦康凯培养基、伊红美蓝琼脂、营养琼脂培养基、营养肉汤、革兰染色液、微量生化鉴定管用于细菌的生化试验等，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3猪大肠杆菌O抗原定型血清诊断液用于细菌的血清型鉴定，购自中国兽医药品监察所。

1.4方法

1.4.1样本采集直接采集新鲜腹泻粪便或先用酒精棉球把仔猪肛门及周边擦拭干净，再用无菌棉拭子采集腹泻仔猪的直肠及死亡猪的十二指肠内容物，置于灭菌离心管中，编号，将装有粪样标本的离心管立即置于4℃泡沫箱，48 h内增菌。无菌采集死亡12 h内仔猪的肝脏和心血等病料，48 h内增菌。

1.4.2大肠杆菌的分离纯化取肛拭子或病料样品接种于营养肉汤溶液，37℃过夜培养，将增菌液用接种环在麦康凯平板“Z”字划线，37℃培养18～24 h后观察培养特性，然后从每个平板挑取至少5个砖红色、圆形凸起的菌落，接种于伊红美蓝琼脂平板，置37℃培养18～24 h，观察分离细菌生长的菌落特点，同时用该菌落涂片，革兰染色、镜检，然后挑取典型菌落再接种于营养肉汤中进行纯菌增殖。

1.4.3生化试验按文献报道方法［11-12］对所有分离株进行10项生化指标的测定。

1.4.4大肠杆菌“O”血清型鉴定参照文献报道方法［12-13］，对分离培养和生化鉴定后的菌株进行“O”血清型鉴定。

2　结果及分析

2.1细菌分离培养及生化鉴定从101团、103团、新湖农场、芳草湖农场等7地区采集疑似初生仔猪腹泻、断奶仔猪腹泻的病死仔猪病料361份，将病料接种于营养肉汤中，经37℃，18～24 h培养，在营养肉汤中呈均匀一致的混浊，361份样品均使营养肉汤变浑浊；麦康凯琼脂培养基上的细菌大多数呈表面光滑湿润，边缘整齐，稍凸起，红色或砖红色菌落；伊红美蓝琼脂培养基上的细菌大多数呈黑褐色，带有金属光泽的菌落。经伊红美蓝和麦康凯培养基纯培养后获得疑似大肠杆菌335株。经葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、吲哚、M.R.、V-P试验、枸橼酸盐利用等10项生化试验鉴定，335株均能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖产酸，均不产生H2S，符合大肠杆菌的生化特性。

2.2血清型鉴定及分布情况分析

2.2.1大肠杆菌0抗原血清型鉴定结果335株仔猪源大肠杆菌血清型鉴定结果见表1，可以看出，335株仔猪源大肠杆菌鉴定出血清型的有258株，占鉴定菌株的76.8%（258/355），72株未能定型，占鉴定菌株的21.4%（72/355），自凝6株，占鉴定菌株的1.8%（6/355）。

2.2.2第六师五家渠市不同地区大肠杆菌O抗原血清型的分布从表2可以看出，各个地区仔猪源大肠杆菌“O”抗原血清型的种类较多，但基本都有主要的优势血清型，如101团、103团、新湖农场、芳草湖农场等7个地区的优势血清型有的相同，有的不相同。相同来源的菌株有相同血清型分布，也有不同血清型分布，而不同来源的菌株也有部分具有相同血清型。

表2　不同地区大肠杆菌O抗原血清型的分布

3　讨论

3.1从第六师、五家渠市7个地区的规模猪场或专业养殖户采集的361份病料，分离仔猪源大肠杆菌335株，有258株鉴定为“O”血清型，共包括17种血清型。这与许多人对不同地区仔猪源大肠杆菌存在多种血清型的报道一致［5-10］。在本次调查中，流行的主要血清型为O14（35株）、O65（31株）、O157（28株）、O24（26株）O138（20株）、O44（19株）、O78（18株）、O9（17株），共194株，占定型菌株的75.1%。同时这些血清型来源的地区也较多，证实O14、O65、O157、O24、O138为优势血清型，代表了目前第六师五家渠市仔猪源大肠杆菌流行的主要血清型。

3.2仔猪源大肠杆菌的血清型复杂，地区分布广泛，而且差异较大。对335株第六师五家渠市仔猪源大肠杆菌进行O血清型定型，定型258株，未能定型72株。定型菌株包括了17种血清型，分别为O8、O9、O20、O65、O101、O138、O14、O24、O78、O147、O4、O157、O35、O44、O27、O18、O6，占分 离菌 株的77.01%。各地区血清型分布差异大，且都有几种血清型存在，101团以O14为优势血清型，占101团分离菌株的11.8%，占101团定型菌株16.9%；103团以O24为优势血清型，占103团分离菌株的22.2%，占103团定型菌株的26.7%；新湖农场和芳草湖农场以O65为优势血清型，占两地分离菌株的15.6%，占两地定型菌株的19.2%；共青团农场以O138为优势血清型，占共青团农场分离菌株的16.7%，占101团定型菌株的18.1%；奇台农场和五家渠市以O157为优势血清型，占两地分离菌株的15.1%，占两地定型菌株的19.1%。有关仔猪源大肠杆菌血清型鉴定国内外报道较多，各地区流行的优势血清型所占的比例相差比较大，该病的防治带来困难，该病预防时，所用疫苗的血清型一定要与当地流行菌株相吻合，否则只能导致免疫效果不良或失败，给养猪业造成严重的经济损失。

3.3本试验所调查的仔猪腹泻大肠杆菌共有17种O抗原血清型，其中5种为优势血清型。不仅第六师、五家渠市流行的血清型与其他省市有较大差别，而且第六师、五家渠市不同地区猪场间亦有不同，同一地区猪场可存在多个血清型，不同地区可流行同一种优势血清型。由此可见，第六师、五家渠市仔猪腹泻大肠杆菌血清型十分复杂，这与猪场不断从外地引进种猪更新猪群，以及这些菌株的变异性和更迭性等有密切关系。而且，各猪场不同时期流行的血清型也不尽相同。因此，必须定期对猪场的大肠杆菌进行分离鉴定或药敏试验，选用针对性较强的菌苗或敏感药物，才能收到较好的防治效果。

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S852.61+2

B

0529-6005（2016）09-0043-03

2015-06-16

2013年新疆生产建设兵团农六师五家渠市科技计划和重大科技专项计划项目（1317号）

马长宾（1982-），男，兽医师，硕士，主要从事动物疾病的防控工作，E-mai：cbinma@163.com