耐酸酵母菌株的筛选及其在酱香白酒酿造过程中的应用研究

卢 君，山其木格，唐 平，王 丽，孟天毅，梁青松，张 乐，冯国跃，李长文

（1.贵州国台酒业有限公司，贵州仁怀 564501；2.天士力控股集团有限公司研究院，天津 300410）

酱香型白酒由于其独特的酿造工艺和酿造环境，形成了发酵过程中特殊的微生物区系，而酵母菌群与酱香白酒的产量和质量都有极为密切的关系[1-2]。参与酱香白酒酿造的酵母菌群种类多样，熊子书和周恒刚在茅台试点实验时分离出了卡尔斯伯酵母、粟酒裂殖酵母、酿酒酵母、白地霉、假丝酵母、球拟酵母、毕赤酵母、掷孢酵母等[3-5]。从功能上讲，酵母菌群主要起到产酒、产香和产多元醇等作用[6]。

酱香白酒发酵过程的糟醅是一种非常复杂的基质，酵母菌的生长代谢易受到糟醅酸度、水分、糖分、淀粉、代谢副产物、疏松度、含氧量等多方面指标的影响。近些年来，由于茅台镇有时会出现极端的天气情况，导致了个别年份茅台镇酱酒企业的普遍减产，损失惨重。这其中主要表现为2 轮次糟醅酸度过高，3 轮次、4 轮次生产掉排。其中重要的原因是糟醅酸度降至pH≤4.5 后，酵母菌的生理代谢活动逐渐受到抑制，对发酵原料的转化利用能力及乙醇的发酵生产能力也逐渐下降，进而导致基酒欠产[7]。因此，筛选具有高耐酸性能的酵母菌株，并强化应用于发酵异常的糟醅中，是解决发酵力不足，基酒产量低的有效途径之一。

本研究从酱香白酒发酵过程中分离大量酵母菌株，并进行分类鉴定。挑选代表性的菌株进行酸度耐受性筛选实验，得到高耐酸性酵母，进一步验证其发酵性能。通过实验室规模液态发酵实验、实验室规模固态发酵实验、实验室规模糟醅发酵实验，验证得到可靠结论后，最终进行生产规模验证实验，并评价耐酸酵母菌株应用于酱香型白酒酿造过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

菌种来源：“国台酒-酵母菌种库”中从酱香白酒酿造过程的糟醅和大曲中分离和保藏的酵母属的菌株共计90株。

材料：高粱、糟醅，均由酒厂提供。

试剂：磷酸二氢钾，分析纯，津威晨化学试剂科贸有限公司；氯化钾、硫酸镁、氯化钙、三氯化铁，硫酸锰，分析纯，天津威晨化学试剂科贸有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、胰蛋白胨，生化试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司；乳酸，分析纯，无锡市亚泰联合化工有限公司。

培养基：YEPD 培养基，WL 培养基[7]，TTC 培养基[8]，高粱汁培养基[9]：首先，取500 g 粉碎后的高粱，粉碎度90%，添加到2 L 的去离子水中，同时添加适量的α-淀粉酶溶液；上述混合溶液，经过2 h的蒸煮后，添加适量的糖化酶，接下来在60 ℃的条件下糖化4 h；取上述经过液化和糖化后的混合液，8000 r/min 离心10 min，上清液即为高粱汁培养液；再加水稀释调整糖度至10 Brix，然后分装，121 ℃灭菌20 min后，备用。

1.2 仪器与设备

电子天平，上海精密科学仪器有限公司；PCR仪MyCyclerTM Thermal Cycler、凝胶成像系统the Discovery Series 及分析软件Quantity One 均购自美国Bio-Rad 公司；琼脂糖电泳装置the Electrophoresis System DYY-6C，购自北京六一仪器厂；超纯水机，法国Millipore 公司；紫外可见分光光度计，HITACHI U3010；显微镜，OLYMPUS BX53F；灭菌锅，山东新华医疗器械股份有限公司；分析天平，METTLER；摇床，上海智诚分析仪器制造有限公司；生化培养箱，天津市天宇实验仪器有限公司；净化操作台，苏州净化设备有限公司。

1.3 试验方法和内容

本研究总体研究方法流程图如图1 所示，以下分步描述方法和内容。

图1 总体研究方法流程图

1.3.1 酵母菌株的形态分类鉴定

采用WL 培养基进行菌落形态分类[7]、采用显微镜观察细胞形态进行分类。

1.3.2 酵母菌株分子生物学分类鉴定

采用5.8s-PCR-RFLP 分析以及ITS 测序的方法进行分类鉴定[10]。

1.3.3 耐酸酵母菌株的筛选

（1）耐酸实验用培养基的配制：配制YEPD 液体培养基，以乳酸调酸度至pH2、pH3、pH4、pH5 四个pH 值梯度。每个试管分装10 mL 培养基，每个样品做两个平行，121 ℃高压灭菌20 min，备用。

（2）不同酸度下酵母菌株生长情况观察：配制YEPD液体培养基，每个三角瓶分装25 mL培养基，121 ℃高压灭菌20 min。待灭菌结束，培养基降温后，接入酵母菌，28 ℃、150 r/min 摇床培养过夜。次日，用血球计数板观察培养液菌浓度，根据实际菌浓度，等量接种于不同酸度培养基中，保证不同酸度培养基中最初菌浓度均为106个/mL。接菌后，28 ℃、150 r/min摇床培养15 h。

（3）分光光度计测量：培养液摇匀，取2 mL 菌液，装入2 mL 离心管，10000 r/min 离心2 min，弃上清液。离心管中加入2 mL 无菌水，悬浮均匀后，即可进行分光光度计测量菌浓度。以无菌水进行调零，测量600 nm处吸光值。

1.3.4 酵母菌株的发酵性能测试

采用TTC 法[8]和杜氏管发酵法[11]进行酵母菌株的发酵性能测试。

1.3.5 耐酸酵母菌株的实验室液态发酵性能测定

将初筛得的菌株接种高粱汁试管于200 r/min、30 ℃培养获得种子液；取250 mL 三角瓶装液量150 mL，接种量均为1×106个/mL。安装发酵栓封口膜密封，30 ℃静置培养，期间称重，发酵终点以日减重量少于0.2 g 为准。发酵结束后记录发酵时间，检测发酵液的总酸、还原糖，以及蒸馏液的酒精度、总酸和总酯含量。

1.3.6 耐酸酵母菌株的实验室固态发酵性能测定

以液化和糖化后的高粱制备固态培养基，菌种接种量、培养方法同1.3.5。发酵结束后检测糟醅的酸度、还原糖、淀粉含量；以及蒸馏液的酒精度、总酸和总酯含量。

1.3.7 耐酸酵母菌株的实验室糟醅发酵性能测定

取酒厂酿酒生产时的糟醅作为培养基，菌种接种量、培养方法同1.3.5。发酵结束后检测糟醅的水分、酸度、还原糖、淀粉含量；以及蒸馏液的酒精度、总酸和总酯含量。

1.3.8 耐酸酵母菌株的生产规模验证实验

选择耐酸、产酒功能明确的酵母菌株，制作成液体培养液，应用于贵州国台酒业有限公司4 轮次生产时4 个不同班组的堆积和窖池发酵过程中。跟踪实验窖池出窖糟醅的理化指标，并且评价实验窖池基酒产质量情况。

1.3.9 测定分析方法

酸度测定采用酸碱滴定法、糖分和淀粉含量采用斐林滴定法，具体检测方法参见《白酒生产技术全书》[12]。

蒸馏液酒精度、总酯、总酸：参照GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[13]。

2 结果与分析

2.1 酵母菌株分类鉴定结果

本研究利用形态学分类和分子生物学分类的方法，针对从贵州国台酒业有限公司酿造过程的糟醅和大曲中分离得到的90 株酵母属的菌株，分类鉴定为7 个不同的种，在鉴定结果的基础上，每种分类结果对应的酵母菌株随机挑选6 株，共计42株，用于后续的耐酸酵母菌筛选实验，结果见表1。

2.2 酵母菌株耐酸性能筛选

以42 株酵母菌株为出发菌株，活化培养后分别接种于不同酸度的培养基中，培养结束后根据菌体浓度来评价酵母菌株的耐酸性能。结果显示粟酒裂殖酵母和酿酒酵母的耐酸性能要高于其他种的酵母，同时还观察到这两种酵母也是糟醅出窖时的优势菌株。说明实验室筛选的耐酸性能结果与酿酒环境自然筛选的结果是一致的。本研究将42株酵母菌株的耐酸性能进行排序，位列前4 位的酵母菌株编号分别为：LJ3、LJ5、NJ2、LJ4。这4 株耐酸菌株在pH2、pH3、pH4、pH5梯度的培养基中的生长情况见图2。

2.3 酵母菌株发酵性能初步筛选

利用TTC 平板法和杜氏管法，对42 株酵母菌株进行发酵性能的初步筛选。根据菌落颜色（红色）的深浅和产气的效果，发现酿酒酵母NJ2 的发酵性能处于前3 位；粟酒裂殖酵母LJ3、LJ5、LJ4 发酵速率较慢，但随着发酵时间的延长，也表现出较强的发酵性能。考虑到耐酸性能是实验最关心的，所以确定这4株酵母作为后续发酵实验的菌株。

表1 酵母菌的菌落菌体形态和RFLP分析鉴定表

图2 酵母菌株耐酸性能筛选结果

2.4 实验室液态发酵实验验证

将筛选出的4 株耐酸酵母菌株LJ3、LJ5、NJ2、LJ4 活化后，分别接种于高粱汁培养基中，于30 ℃静置培养，每隔24 h振荡称重，记录失重量，发酵过程的产气情况见图3。发酵结束后，检测发酵液和蒸馏液的理化指标，结果见表2。

由图3 能够看出，酿酒酵母NJ2 的发酵速率明显高于粟酒裂殖酵母LJ3、LJ5、LJ4。两种酵母表现出了不同的发酵性能，实验结果认为，这两种酵母对于酱香白酒发酵都是不可或缺的，既需要发酵速率快的酵母，也需要符合“前缓、中挺、后缓落”规律的酵母菌株，共同参与酱香白酒酿造过程中。

图3 实验室液态发酵实验产气结果

由表2看出，酿酒酵母NJ2发酵时间更短，而粟酒裂殖酵母LJ3、LJ5、LJ4，虽然发酵时间更长，但是却表现出了更高的产酒能力。

2.5 实验室固态发酵实验验证

将筛选出的4 株耐酸酵母菌株LJ3、LJ5、NJ2、LJ4 活化后，分别接种于高粱培养基中，于30 ℃下静置培养，发酵结束后，检测发酵后高粱和蒸馏液的理化指标结果见表3。

表2 耐酸酵母液态发酵实验性能指标

表3 耐酸酵母固态发酵实验性能指标

由表3 看出，固态发酵时，所有酵母表现出比较相似的发酵能力，其中粟酒裂殖酵母LJ3 的产酒能力更强。

2.6 实验室糟醅发酵实验验证

将筛选出的4 株耐酸酵母菌株LJ3、LJ5、NJ2、LJ4 活化后，分别接种于酒厂实际生产时4 轮次的入窖糟醅样品中，于30 ℃下静置培养，每隔24 h 振荡称重，记录失重量，发酵过程的产气情况见图4。发酵结束后，检测糟醅和蒸馏液的理化指标结果见表4。

表4 耐酸酵母糟醅发酵实验性能指标

由图4 可以看出，利用酿酒过程的糟醅作为培养基，验证4 种耐酸酵母菌时，发酵速率差异并不大。发酵过程添加了酵母菌株后，相比于原始糟醅，发酵速率都有明显增加。并且，粟酒裂殖酵母的最高产气量要高于酿酒酵母。

从表4 能够看出，利用酿酒过程的糟醅作为培养基，添加酵母后，蒸馏液的酒精度均有明显提升，总酯的含量小幅提升，其他理化指标差别不大。

图4 实验室糟醅发酵实验产气结果

2.7 耐酸酵母菌剂生产应用发酵实验

根据以上实验室液态、固态、糟醅发酵实验积累的验证结果，我们最终选择应用酿酒酵母NJ2 和粟酒裂殖酵母LJ3 作为强化菌株，两种酵母培养液按1∶1 比例混合作为耐酸酵母菌剂，从4 个不同班组各选择1 个窖池作为实验窖池（该班组其余正常生产的窖池作为对照窖），分别投入4 轮次生产过程的糟醅堆积阶段和入窖阶段。跟踪发酵的进程，发酵结束后检测出窖糟醅的理化指标，见表5，基酒的产量变化见表6。

表5 耐酸酵母菌剂生产应用发酵实验理化指标

表6 耐酸酵母菌剂生产应用试验基酒的产量变化

由表5、表6 可看出，在强化了耐酸酵母菌剂之后，出窖糟醅的各项理化指标未见明显变化。而基酒产量却有明显的提高，提高比率在13.47 %～25.97%之间，说明在糟醅发酵力不足时，提高耐酸酵母的生物量对于提升基酒的产量有直接的联系。对于质量的评价，使用耐酸酵母菌剂后实验班组的基酒均符合轮次基酒风格特征的要求，除口感略偏甜外，其他风味指标没有明显差异。

3 结论

本研究从酱香白酒发酵过程中筛选得到4 株耐酸性能良好的酵母菌株，鉴定结果显示为1 株酿酒酵母和3 株粟酒裂殖酵母。通过实验室液态、固态、糟醅发酵实验，验证了这4 株酵母菌的发酵性能，优选出酿酒酵母NJ2 和粟酒裂殖酵母LJ3 作为强化菌株，应用于生产的发酵实验。结果显示，在强化了耐酸酵母菌剂之后，出窖糟醅的各项理化指标未见明显变化。而基酒产量却有明显的提高，提高比率在13.47%～25.97%之间，基酒质量除口感略偏甜外，其他风味指标没有明显差异。本研究筛选到的耐酸酵母菌株和采用的技术，可有效应对茅台镇有时会出现极端天气导致的2 轮次糟醅酸度过高，发酵力不足，3 轮次、4 轮次生产掉排现象。作为一种储备的应急技术，对于企业来说具有实际的应用意义。