安琪根霉曲在小曲清香型白酒酿造生产中的应用分析与探讨

潘天全，程 伟，张 杰，李 娜，彭 兵，巩子路，吴丽华，吴宏萍

（1.安徽金种子酒业股份有限公司，安徽阜阳 236023；2.安徽金种子集团有限公司检测中心，安徽阜阳 236018）

随着科技的发展，社会物质生活丰富，白酒作为嗜好性食品，演变发展到目前多酒种、多香型共存的状况。目前，我国白酒有浓香型、酱香型、清香型、兼香型、米香型、凤香型、芝麻香型、豉香型、特香型、董香型、老白干香型和馥郁香型十二大类香型；其中，小曲清香型白酒是我国白酒酿酒历史上最古老的酒种之一[1]。固态法小曲清香型白酒是中国蒸馏白酒的重要组成部分，以粮谷为主要酿造原料，小曲为糖化发酵剂，经蒸煮摊晾、培菌糖化、续糟发酵、蒸馏、陈酿、勾兑而成，其出酒率高、发酵周期短，以乙酸乙酯为主体香，其风味特点是“清香纯正、自然协调、醇甜柔和、后味爽净”等[2]。霉菌在各类酒曲中都普遍存在，是我国酒曲微生物的重要组成部分。霉菌具有糖化力强的特点，并能产生多种影响酒类风味的物质，在白酒发酵过程中发挥着重要作用。常用于白酒酿造的霉菌主要包括：根霉属(Rhizopus)、曲霉属(Aspergillus)、毛霉属(Mucor)、犁头霉属(Absidia)、青霉属(Penicillium)等[3]；其中，根霉属作为一种糖化力极强的霉菌，广泛存在于各种酒曲中。根霉作为极其重要的酿酒微生物，其在粮醅糖化过程中的作用十分显著。目前，关于根霉产酶特性的研究较多，纯种根霉制曲已广泛应用于酿酒生产，根霉在我国酒类酿造业中的作用已无可替代。在固态法小曲清香型白酒发酵中使用根霉曲，可进一步提高发酵效率，提高出酒率，提高原酒中乙酸乙酯的含量，增酯降醇，提高小曲酒质量，从而提升产品竞争力。本文结合生产实践，对安琪根霉曲在小曲清香型白酒酿造生产中的应用进行了分析与探讨，以期为根霉曲在白酒酿造生产中的应用提供借鉴依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

样品与材料：发酵粮醅等取自正常生产的固态小曲清香型白酒酿造车间；根霉曲，湖北安琪酵母股份有限公司生产；清香型小曲，企业制曲车间生产。

仪器与设备：安捷伦7820B 型气相色谱仪、安捷伦气相色谱-质谱联用仪（GC-MS，5975C+7890A，EI 源）等；不锈钢发酵箱（自制）、酒醅取样器（自制）等。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程及操作要点

操作要点：（1）原料处理：优质高粱，无霉变，无虫蛀等，用温水浸泡20～24 h 后，滤水后投入压力蒸料锅清蒸；（2）蒸粮：根据原料特性及蒸煮糊化效果，一般初蒸15～20 min，敞盖焖水50～55 min 后，再复蒸30～40 min；（3）培菌糖化：待蒸熟的物料扬散冷却至30 ℃左右接入清香型小曲、安琪根霉曲等作为试验组，对照组接入清香型小曲；同时，堆积糖化床平铺清蒸后的稻壳，再平铺粮醅进行堆积培菌糖化，并控制温度、通风、时间等条件；（4）入箱发酵：粮醅培菌糖化后拌入原料总质量2～3 倍的新鲜糟醅，混合均匀后通风降温至22～24 ℃，投入发酵箱密封发酵15 d，蒸馏取酒。

1.2.2 根霉曲的生产应用

试验组：向培菌糖化的清香型粮醅中添加原料总质量1.0 %的清香型小曲，再添加原料总质量0.5 %的安琪根霉曲。对照组：向培菌糖化的清香型粮醅中添加原料总质量1.0 %的清香型小曲，不添加安琪根霉曲。

1.2.3 取样及分析检测方法

1.2.3.1 粮醅的取样及处理方法

选择堆积糖化床的前、中、后等3 个位置段的中央位置，粮醅表层10 cm 左右的深度（中层位置）作为取样点，并在粮醅堆积开始及结束的时间点分别取样，样品取回后混合均匀并及时处理分析。分别采用烘干法测定水分含量，浸泡滴定法测定酸度，斐林试剂法测定还原糖含量。

准确称取15 g 粮醅放入300 mL 的三角瓶中，用量筒准确量取150 mL 无水乙醇倒入三角瓶中，摇匀后浸泡24 h 再进行蒸馏处理，用量筒准确收集前蒸馏液100 mL 备用。取收集的80 mL 蒸馏液采用二氯甲烷液对酒样进行萃取，V（二氯甲烷）∶V（酒样）=1∶1，重复3 次萃取，经中低温加热并抽真空除去液体中的二氯甲烷，使样液浓缩至5 倍进行GC-MS 检测分析；另外，取收集的20 mL 蒸馏液进行气相色谱分析。

1.2.3.2 发酵酒醅的取样及处理方法

发酵酒醅每间隔1 d 取样，发酵周期为15 d，采用发酵箱对角线上取两角和中心3 个取样点，每点再分别取发酵箱上层、中层、底层3 个取样点，样品取回后混合均匀并及时处理分析。

发酵酒醅样品与粮醅样品的GC-MS分析前处理方法相同。

1.2.3.3 挥发性风味成分的GC-MS分析方法

载气为氦气（99.999 %），柱流速1.0 mL/ min；初始温度40 ℃，保持12 min；以3 ℃/ min 升至108 ℃，保持2 min；再以5 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。进样量1.0 μ L，采用分流进样，分流比50∶1，进样口温度250 ℃。质谱条件：离子源温度230 ℃，电离方式EI，电子能量70 eV，扫描质量范围45～550 amu，检索谱库为NIST 质谱数据库，溶剂延迟1.0 min。

1.2.3.4 气相色谱分析条件

配有氢火焰离子化检测器（FID）的气相色谱仪，白酒分析专用填充柱（柱长2 m），氢气流速30 mL/min、氮气流速40 mL/ min、空气流速300 mL/ min，柱温90 ℃、等温，进样器温度150 ℃，检测器温度150 ℃。

1.2.3.5 原酒分析

统计发酵原酒的产量、酒精度等，采用气相色谱法检测主要风味物质的含量，酸碱滴定法检测总酸含量，蒸馏-皂化法检测总酯含量。对比相关指标变化，计算乙乳比等，并结合品评意见等因素，综合分析安琪根霉曲在小曲清香型白酒酿造生产中的应用效果。

2 结果与分析

2.1 根霉曲的应用工艺分析与探讨

2.1.1 酿酒小曲的制备

小曲作为糖化发酵剂被广泛应用到酿造黄酒和小曲酒中，传统小曲制备多是使用米粉、米糠或麸皮等，有的添加一些中草药，或者少量白土（观音土），再接入种曲，加入适量水制成曲坯或曲团，在合适的温度和湿度下培养而成，因其曲块体积较小，习惯上称为小曲[4]。金种子传统小曲的制备工艺采用生料制曲，以麸皮等为主要原料，配料混合均匀加入50%～60%的水，添加活化后的根霉、生香酵母和酒精酵母等，翻拌均匀后入室培养。冬季小曲曲坯表层可加盖草帘，夏季表层可加盖纱布防止杂菌感染，同时防止水分挥发。入室培养第2 天根据小曲升温情况进行翻曲，曲坯入室培养5 d 左右即可出室，40 ℃通风干燥或晾晒粉碎后使用。采用纯种根霉和酵母进行培菌制曲，与其他传统小曲比较，纯种制曲具有用曲量少、出酒率高、酒质稳定等特点。

2.1.2 根霉曲及其生产应用

根霉既能产糖化酶，也能产液化酶（α-淀粉酶），根霉产糖化酶的能力更强且活性高，能将淀粉充分转化为葡萄糖。研究表明[5-6]，根霉比较“娇嫩”，生长速度慢,多数根霉最适生长温度为30～33 ℃，酶生成温度比生长温度略高，最适产酶温度在33～35 ℃；根霉对含水量要求较高，水分过高或过低都不宜于根霉的生长繁殖，根霉的最适生长环境含水量为52%～54%。随着纯种制曲技术的发展与应用，当前，以麸皮为原料的纯种根霉曲在小曲酒酿造生产中得到广泛使用[7]。根霉曲的制备工艺决定着根霉曲的质量标准，安琪酵母公司生产的根霉曲采用液固培养法工艺，斜面菌种经三级纯种液态扩大培养，固态通风培养，快速低温干燥等制备，以麸皮等为载体，粉末状至不规则颗粒状，颜色近似麦麸，色质均匀一致，无杂色，具有根霉曲特有的曲香，无霉杂气味等。安琪根霉曲水分≤10 %，阴凉干燥处保存保质期为12 个月。小曲白酒酿造工艺具有用曲量小、发酵周期短、出酒率高、生产设备简易、成本低廉、适合于机械化生产等特点。传统小曲采用自然接种培养制备，成品小曲不仅含有根霉、酵母等酿酒功能菌，而且还含有各种杂菌；因杂菌的存在会导致出酒率下降、酒质不稳定等弊端。

本研究对传统的小曲清香型白酒酿造工艺进行调整，将根霉曲应用到小曲清香型白酒的培菌糖化过程中，以配合小曲微生物参与粮醅的培菌糖化过程。根霉有一定的产酒精的作用，能边糖化边发酵的过程中产生乳酸、琥珀酸、苹果酸和延胡索酸等有机酸；此外，在一定条件下根霉还能产生如乙醛、乙酸乙酯、异丁醇、异戊醇、乳酸乙酯、乙酸、苯乙醇等风味物质[8]。合理有效地添加根霉曲能够抑制培菌糖化及发酵过程中有害杂菌的生长，提高曲料的酒化能力，增加与丰富酒体风味成分、改善口感等，保证了酒体风格，对提高出酒率起到积极作用。

2.1.3 小曲清香型白酒的酿造生产工艺（图1）

小曲清香型白酒以粮谷为主要酿造原料，小曲为糖化发酵剂，经蒸煮摊晾、培菌糖化、续糟发酵、蒸馏、陈酿、勾兑而成，其具有出酒率高、发酵周期短、醇香清雅、糟香突出、回味协调、余味爽净等特点。泡粮后的高粱经过回收蒸汽预热约10 min，预热后进入连续蒸煮机带压初蒸，初蒸时间控制在15～20 min，初蒸结束后进入隧道式连续焖水机直接焖水，焖水时间由高粱品种而定，焖水后粮粒连续出料后，再次入连续蒸煮机复蒸30～40 min。在线控制初蒸压力、初蒸时间、焖水温度、焖水时间、复蒸压力、复蒸时间等，粮食蒸煮后，可达到较好的糊化效果[9]。在粮醅糖化过程中糖化酶活力整体呈先上升后下降的趋势，当糖化温度为30～33 ℃时，其糖化酶活力最大，即糖化酶活力主要与糖化粮醅的温度有关，在酵母菌、根霉菌的最适宜生长温度时，酶活力达到最大[10]。因此，应严格控制粮醅培菌糖化工艺，其中，粮醅的水分、酸度、蒸料效果等，以及培菌糖化的温度、通风、时间等直接关系到糖化效果，进而影响出酒率与产酒风格。

应用根霉曲的酿造工艺调整后，在加入小曲的基础上再加入根霉曲，并控制粮醅的含水量，培菌糖化温度达到30～33 ℃，时间在20 h 左右，即可配糟入箱密封发酵。培菌糖化后拌入原料总质量25 %左右的新鲜糟醅，混合均匀后通风降温至22～24 ℃，投入发酵箱密封发酵15 d 左右，即可出箱蒸馏取酒。粮醅入箱发酵过程中，应及时检查发酵容器的密封性，并观察发酵温度变化，或采用发酵间集中放置发酵箱并控制温度等方法实现发酵温度的控制[11]。

2.2 粮醅培菌糖化效果及其挥发性风味成分分析

2.2.1 粮醅培菌糖化效果比较（表1）

表1 粮醅培菌糖化效果比较

小曲清香型白酒的酿造生产原料主要为高粱，采用堆积培菌糖化工艺，其使用的根霉曲具有边生长边糖化等作用，在淀粉向还原糖转化过程，可增加粮醅的酒香与复合香。由表1 可知，试验组粮醅培菌糖化后还原糖和酸度等理化指标均比对照组高，还原糖含量比对照组高20%左右，培菌糖化后的粮醅闻香优于对照组，表明根霉曲在粮醅培菌糖化过程中有协同传统小曲进一步促进粮醅糖化的作用。

图1 小曲清香型白酒的酿造生产工艺流程

2.2.2 粮醅培菌糖化前后挥发性风味成分分析（图2）

图2 粮醅培菌糖化后的GC-MS挥发性风味成分分析谱图

HS-SPME 技 术、GC-MS 技 术、GC×GCTOFMS 技术等现代分析技术在白酒香味成分的定性和定量分析研究上广泛应用。由图2 可知，应用GC-MS 技术分析粮醅培菌糖化后试验组的色谱峰比对照组的色谱峰要多，表明试验组粮醅中挥发性风味成分的种类较丰富。由表2 可以看出，试验组或对照组粮醅堆积后的挥发性风味成分都比堆积前要多，可表明，粮醅在培菌糖化前期所接种的微生物代谢活动较弱，粮醅在培菌糖化过程中，所接种的微生物代谢活动逐渐增强促进了风味物质的生成。

由表2 可知，试验组中酯类物质11 种，醇类物质4 种，酸类物质3 种，其他类物质2 种；对照组中酯类物质9 种，醇类物质3 种，酸类物质2 种，其他类物质2种；粮醅培菌糖化前含酯类物质9种，醇类物质未检出，酸类物质2种，其他类物质2 种。试验组与对照组在培菌糖化后都产生苯乙醇等醇类物质，可能是由于在培菌糖化的过程中，某些细菌将葡萄糖发酵产生酒精，生成的醇类物质；试验组中的酯类物质多于对照组及粮醅培菌糖化前，表明试验组所添加的根霉曲对培菌糖化过程中的酯化反应有促进作用，同时根霉也具有代谢产酸产酯能力。试验组中的酸类物质多于对照组及粮醅培菌糖化前，可能是由于根霉在生长过程中产生柠檬酸、葡萄糖酸、乳酸、琥珀酸等有机酸所致[12]。

2.3 酒培发酵过程中主要理化指标的检测与结果分析

2.3.1 酒醅中乙酸乙酯、乳酸乙酯等的含量变化

酯类是一类具有特殊芳香性气味的化合物，是白酒中重要的芳香类物质，主要起呈香作用，可以在不同程度上增加酒的香气，决定酒香气的品质，对白酒香型确定起着重要作用。小曲清香型白酒中主要呈香物质为乙酸乙酯和乳酸乙酯等；其中，乙酸乙酯又称醋酸乙酯，沸点为77 ℃，感官阈值为17.00 mg/L，具有苹果样香气，味刺激带涩，味短[13]。由图3 可知，试验组与对照组中乙酸乙酯的含量在发酵过程中整体呈上升趋势，其在发酵1～4 d 时上升的幅度较大，4～11 d 时含量基本稳定，11～15 d时又有所上升；粮醅发酵15 d 时出池，试验组中乙酸乙酯的含量为24.5 mg/L，对照组中乙酸乙酯的含量为20.3 mg/L，试验组中乙酸乙酯的含量是对照组的1.21 倍，发酵结束时，试验组中乙酸乙酯的含量明显高于对照组。

乳酸乙酯为无色液体、略有气味，是清香型白酒中主要的香味物质之一；其含量适当，即乳酸乙酯与乙酸乙酯比例恰当，会使清香型白酒的酒体柔和协调，反之，则会使酒体苦涩不协调。任道群等[14]的研究表明，根霉在对混合酸与乙醇的催化过程中，对乳酸乙酯的生成有一定的作用。由图3 可知，试验组与对照组中乳酸乙酯的含量均呈明显上升趋势，发酵1～5 d时，对照组中乳酸乙酯含量要比试验组中略高，发酵5 d以后，实验组中乳酸乙酯含量比对照组中高；粮醅发酵15 d 时出池，试验组的乳酸乙酯含量为25.7 mg/L，对照组中乳酸乙酯的含量为20.7 mg/L；试验组的乳酸乙酯含量是对照组的1.24倍，发酵结束时，试验组中乳酸乙酯的含量明显高于对照组。

表2 粮醅培菌糖化前后试验组与对照组GC-MS挥发性风味成分分析结果

图3 小曲清香型白酒发酵酒醅中乙酸乙酯、乳酸乙酯等含量的变化

2.3.2 酒醅中异戊醇、杂醇油等的含量变化

醇类化合物是清香型白酒中重要的呈味物质，也是此类酒中总含量最高的一类风味成分。在醇类化合物中，正丙醇、异戊醇、异丁醇、仲丁醇等的含量较高，清香型白酒的口味特点是入口微甜，刺激性较强，带有一定的爽口苦味等，这很大程度上与醇类化合物的含量及比例有直接关系。正丙醇在一定浓度范围内，口味会出现类似清香型小曲酒落口干爽带苦的特点，若浓度过低将不会出现这种口味特征[15]。影响白酒口味的成分不可能是一种成分，白酒口味还受到其他组分的共同影响。在清香型小曲酒特定组分构成条件下，正丙醇及其他醇类(异戊醇、异丁醇、仲丁醇)确实形成了清香型小曲酒的特殊口味特征。由图4 可知，试验组与对照组中正丙醇的含量均整体呈上升趋势，发酵1～3 d对照组中正丙醇含量高于试验组，发酵5～11 d 实验组与对照组中正丙醇含量交替上升；粮醅发酵15 d 试验组与对照组中正丙醇含量趋于相近；酒醅出池时试验组中正丙醇的含量为8.37 mg/L，对照组中正丙醇的含量为8.43 mg/L。

图4 小曲清香型白酒发酵酒醅中正丙醇、杂醇油等的含量变化

杂醇油有时也泛指高级醇，是一类高沸点的混合物，通常为淡黄色至棕褐色的透明液体，是具有挥发性的特殊香味物质。杂醇油主要成分包括正丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、正戊醇、异戊醇等，少量杂醇油可构成白酒的不同风格。如果白酒中没有杂醇油或其含量过少，酒味将会十分淡薄；如果含量偏高，就会使酒产生苦味或涩味，过量摄入杂醇油也会对人体造成危害[16]。由图4 可知，试验组与对照组中杂醇油的含量均整体呈上升趋势，发酵1～3 d 试验组中杂醇油含量高于对照组，发酵3～5 d 对照组中杂醇油含量高于试验组，发酵5～15 d 试验组中杂醇油含量高于对照组；酒醅出池时，试验组中杂醇油的含量为4.03 mg/L，对照组中杂醇油的含量为3.86 mg/L，表明粮醅发酵结束时试验组中杂醇油的含量略高于对照组。

2.4 原酒色谱指标的检测与结果分析（图5）

图5 根霉曲酿造小曲清香型白酒的原酒色谱指标对比分析

优质清香型白酒的基酒中，主体香味成分乙酸乙酯的含量较高，乳酸乙酯含量仅次于乙酸乙酯，这是清香型白酒香味组分的重要特征。乙酸乙酯和乳酸乙酯的绝对含量及两者的比例关系，对清香型白酒的质量和风格特征起到重要影响。一般乙酸乙酯与乳酸乙酯的含量比例为1∶0.6～0.8，若乳酸乙酯含量超过这个比例浓度，将会影响清香型白酒的风味[17]。由图5 可知，试验组中的乙乳比为1.92，对照组中的乙乳比为1.42，乙乳比从1.42提高到1.92，对小曲清香型白酒的品质有重要提升作用。

以上各成分色谱指标含量均为原酒降低酒精度到58%vol 时的检测结果，产酒数据统计结果表明，应用根霉曲酿造工艺调整后，积极协同促进了粮醅的培菌糖化效果，原料出酒率有所提高，表明粮醅的培菌糖化工艺及其效果与原料出酒率密切相关。由图5 可知，试验组中乙酸乙酯的含量约为对照组的1.10 倍；试验组中甲醇、正丙醇、杂醇油等的含量与对照组差别不大，试验组中总酸含量略高于对照组，试验组中总酯的含量略高于对照组。与对照组对比表明，试验组中原酒的乙酸乙酯含量提高9.8%，总酯含量提高7.1%，总酸含量提高7.8%，乙乳比由1.67 提高到2.38，原酒香味更加丰富协调，清香纯正、突出，从而实现了原酒品质的进一步提升。

3 讨论与总结

根霉曲包括根霉甜酒曲和根霉酒曲，根霉甜酒曲以根霉为菌种，经固态或液态纯种培养而成，通常用于糯米或其他粮食原料酿制甜酒，以供直接食用。根霉酒曲在纯根霉曲中按一定比例加入纯酵母，主要用于以大米、玉米、高粱等粮食原料配制小曲酒[18]。白酒香型分类的影响因素主要包括：用曲、工艺、发酵容器、风味物质等因素，根据风味物质的种类和含量差异确定不同香型，酯、醇、醛、酸等是其中最为重要的成分，根霉对这些物质的生成都有一定的影响。小曲清香型白酒与大曲清香型白酒或其他香型白酒相比，风味物质的种类较少、含量较低，其酯类物质的含量具有较大的提升空间。为提高小曲清香型白酒的品质，本文对安琪根霉曲在小曲清香型白酒酿造生产中的应用进行了分析与探讨。结果表明，在小曲清香型白酒原生产工艺的基础上添0.5 %的安琪根霉曲，与对照组相比，粮醅培菌糖化后挥发性风味成分的种类有所增加，尤其是酸类和酯类物质增加明显，根霉曲配合小曲使用积极协同促进了粮醅的培菌糖化作用，酒醅中的乙酸乙酯、乳酸乙酯等风味物质含量变化对比明显，原酒中乙酸乙酯含量提高9.8%，总酯含量提高7.1 %，总酸含量提高7.8 %，乙乳比由1.42 提高到1.92，原酒风味协调，清香纯正、突出，从而提高了原酒品质。