多菌种纯种微生物在绵柔型芝麻香白酒中的应用

2019-11-12张建良于飞跃杨海波

酿酒科技 2019年10期

张建良，于飞跃，杨海波，李行

（江苏乾隆江南酒业股份有限公司，江苏宿迁 201700）

白酒是我国的传统优势食品，产业规模较大、经济贡献率较高，是食品工业的支柱产业之一。近年来，我国白酒行业尽管受到诸多因素的影响，但仍保持了较快的发展势头，未来白酒产业的经济发展仍将保持稳定的增长[1]。随着经济的高速发展，人际交往越为密切和频繁。这种背景下促进了交际主平台餐饮业的爆发性成长。无酒不成席，酒不仅是传统意义上的一种饮用享受(享受型消费)，也是中国人社交礼仪的重要道具(交际型消费)。近几年，随着消费者健康保健意识的增强，白酒消费已明显出现低度化、清淡化、健康化、绵柔化的趋势，正是这种饮酒与健康的矛盾，给绵柔型芝麻香白酒带来了极大的发展机遇[2]。微生物菌群在白酒酿造过程中起着重要作用，它是酒体质量、产量的重要保证。主要包含霉菌、细菌和酵母菌三大类[3-4]。本研究从芝麻香大曲、粮醅和酒醅中筛选分离出1 株耐高温酵母和3 株高温细菌，经驯化和纯菌种培养，用于绵柔型芝麻香白酒的制曲。又采用多粮高氮配料和高温发酵工艺，促进了功能因子的生成，提升了绵柔型芝麻香白酒酒体口感的绵柔度、丰满度和综合品质。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

样本：用于菌株分离的芝麻香大曲、粮醅、酒醅，源于本公司。

原辅料：高粱、小麦、麸皮、大米、糯米、玉米等由本公司采购。

仪器设备：2 cm 50/30 μ m 固相微萃取三相头divinylbenzene/carboxen/poly(dimethylsiloxane)(DVB/CAR/PDMS)购于上海Sigma-Aldrich 贸易有限公司；水为Milli Q 超纯水(Millipore，Badford，MA，USA)；全二维气相色谱-飞行时间质谱仪(GC×GC-TOFMS，Pegasus 4D，LecoCorporation，USA)，其中GC × GC 系统由安捷伦7890N 气相色谱和冷喷调制器KT-2001 组成，质谱检测器为美国LECO Pegasus 4D飞行时间质谱。

1.2 试验方法

1.2.1 优势菌株筛选

采用平板划线法和稀释涂布法：分离样品经富集培养，适当稀释后平板划线或稀释涂布，挑选单菌落。酵母菌筛选时富集温度为45 ℃，为避免细菌和霉菌之间的干扰，富集时在培养基中分别加入100 mg/L 的氨苄青霉素和制霉素。细菌富集温度为65 ℃。

1.2.2 强化制曲

优势菌株分别进行纯培养，按比例混合复配，接入制曲料中，按传统方法进行制曲，制曲温度控制在65～70 ℃。

1.2.3 多粮高温发酵

高粱、小麦、麸皮、大米、糯米、玉米按比例混合，接入纯培养技术制成的绵柔型芝麻香白酒复合多微功能曲，通风堆积发酵48 h，转入窖池发酵36 d。

1.2.4 风味物质成分分析

顶空固相微萃取(HS-SPME)：取2 mL 白酒样品，8 mL 超纯水及3.0 g 氯化钠于20 mL 顶空瓶混合均匀，用带PTFE/蓝色硅胶隔垫的空心磁性金属盖密封后由MPS 2 进行HS-SPME，实验过程参照文献方法[5]。HS-SPME 萃取及进样过程由Gerstel 公司多功能自动进样系统(MPS 2)完成，萃取头为2 cm 50/30 μ m DVB/CAR/PDMS 三相萃取头。萃取温度50 ℃，样品平衡时间5 min，萃取时间50 min，乳化器转速500 r/min。完成萃取过程后萃取头于GC 进样口250 ℃解吸附5 min，进行GC×GC-TOFMS分析。

全二维气相色谱、飞行质谱（GC×GC-TOFMS）分析：一维色谱柱DB-5MS(30 m×0.25 mm ID，0.25 μ m)，二维色谱柱Rxi-200(1.5 m × 0.18 mm ID,0.2 μ m)色谱条件：GC 进样口温度250 ℃，进样模式采用不分流模式进行。第一维柱温箱升温程序：起始温度40 ℃保持2 min 后，以5 ℃/min 升温至230 ℃保持5 min。调制器调制时间为4 s，热调制时间为1 s，调制补偿温度为20 ℃。第二维柱温箱升温程序：起始温度60 ℃保持2 min，后以5 ℃/min 升温至250 ℃保持5 min。样品运行采用恒流模式，载气为高纯氦气(纯度＞99.9995 %)，流速为1 mL/min。

图1 优势菌株分离

质谱条件：EI 离子源，电压为70 eV，离子源温度为230 ℃，传输线温度为280 ℃。检测器电压为1365 V。采集质量数范围为35～500 amu，采集频率为100 spectrum/s。数据采集由LECO 公司Pegasus 4D工作站控制。

GC×GC-TOFMS 数据处理：实验采集的TOFMS 数据由美国力可（LECO）公司ChromaTOF工作站进行数据处理，自动识别信噪比大于50 的色谱峰后进行自动积分解卷积和质谱库比对，质谱库为NIST 14 和Wiley 9，所有比对结果自动生成峰形图谱。峰形图谱经过进一步人工解谱及同系物二维色谱出峰规律比对验证后作为初步鉴定结果。最后剔除烷烃类等没有风味贡献的化合物，选择相似度大于800，反相似度大于800，可能性大于4000的化合物作为最终鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选与分离

芝麻香大曲、粮醅和酒醅为分离样品，采用高温富集驯化、平板稀释划线的方法进行菌株的分离，获得了1 株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、1 株耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)、1株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和1 株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），部分结果见图1。

该酵母菌耐高温，可以在50 ℃生长，产醇产酯能力强；两株芽孢杆菌可以在70 ℃生长，产淀粉酶活力较高；乳酸菌具有较高的耐酸能力。微生物菌群是酿造的灵魂，黄淮流域独特的区域优势造就了独特的酿造微生物。上述核心功能微生物分离于芝麻香的大曲、粮醅和酒醅，将其应用到绵柔型芝麻香白酒的生产中，有利于绵柔型芝麻香白酒独特风格和功能因子的形成，提升产品品质。

2.2 多菌株纯培养强化制曲

将上述4 株菌分别进行纯培养，按一定比例混合，与传统芝麻香麸曲工艺相结合，进行强化制曲。基于纯培养菌株的耐热特性，制曲温度可以从传统的62 ℃提高到65～70 ℃，有效抑制了杂菌的生长，为绵柔型芝麻香白酒典型风味物质和功能因子的形成奠定了生态基础。绵柔型芝麻香白酒复合多微功能曲，是多菌种纯培养技术的成功应用，它能够使酿造性能稳定，精准控制微生物，大幅度提高绵柔型芝麻香白酒酒体口感的绵柔度、丰满度，调控白酒质量，增加白酒风味物质和功能因子，提升白酒口感舒适度和利于健康的有益成分。

2.3 多粮高温发酵

以高粱和小麦为主原料，麸皮、大米、糯米、玉米为辅料合理配比，接入纯培养技术制成的绵柔型芝麻香白酒复合多微功能曲，高温两段式发酵。

第一段采用开放式发酵（堆积发酵），更大限度的增加微生物与空气的接触面，使微生物代谢更加旺盛，保证重要风味物质及其前体物质的形成。第二阶段采用密闭式发酵（窖池发酵），通过控制入池温度、分层踩窖及使用窖池专用布泥封窖池等方式，优化入池工艺参数，实现对酒醅功能微生物结构和功能的定向调控，保证绵柔型芝麻香白酒独特风格的形成。

经实践表明，辅料整粒投料有助于提升酒醅的骨力，有利于促进微生物的生长和发酵，并且将原辅料用热水浸泡，有助于原辅料吸水糊化，在蒸煮时，采用谷糠放在原辅料上一起清蒸，能够有效去除原辅料上的邪杂味，同时原料也达到了一定程度的糊化，利于培菌糖化。堆积结束后，温度设置为40～45 ℃，有助于正常发酵、产酯，产出的酒与现有的芝麻香型相比，入口圆润醇和，无杂味，细腻丰满，具有明显的感官特征和独特的个性。采用热水泡粮及原料清蒸，有助于高粱淀粉吸水糊化，蒸煮时易透心，有利于醇甜物质生成，能够有效排除因混合蒸烧而带来的生料味及异杂味，又可以提升酒质的纯净度和口感的爽净度。与现有技术相比，采用多菌株纯培养高温发酵工艺，产出的酒香气幽雅飘逸，入口绵柔醇厚，无杂味，具有明显的感官特征和独特的个性。

2.4 风味物质成分分析

二维气相色谱解决了一维色谱峰容量低、分离度不好的问题。本文采用全二维气相色谱-高分辨质谱，从绵柔型芝麻香白酒中共检测到517 种挥发性组分，其中酯类145 种，醇类69 种，酸类25 种，醛、酮、缩醛类92 种，含氮组分25 种，呋喃类32 种，烯萜类17种，其他89种。

2.4.1 主要风味物质

白酒中的有机酸、醇、酯、醛酮成分是主要风味物质[6]。采用气相色谱法分析绵柔型芝麻香白酒的挥发性成分，结果见表1。由表1 可以看出，绵柔型芝麻香白酒有机酸种类和含量较高，总醇的含量较高，醛、酮类化合物的总量较高，酯类化合物种类多。较高的多元醇含量与适当的酸含量是绵柔型芝麻香白酒典型风格的物质基础。

2.4.2 含硫化合物

挥发性含硫化合物由于其极低的香气阈值和独特的香气特征，成为食品中一类十分重要的香气物质，在食品风味化学研究中受到广泛关注[7]。但由于挥发性含硫化合物化学结构多样，性质不稳定，大多在食品中浓度低，因此很难被检测到。本文利用全二维气相色谱-TOF 质谱，采用顶空萃取进样的方式，从绵柔型芝麻香白酒中检测到23 种含硫化合物，如表2 所示，其中17 号3，4-二甲基噻吩首次从白酒中检测到。这些硫化物的检出对进一步研究挥发性组分对构成绵柔型芝麻香白酒独特的香气特征具有重要作用。

绵柔型芝麻香白酒的指纹谱见图2。从指纹谱分析可以看出，绵柔型芝麻香白酒中的挥发性成分与清香型、浓香型和酱香型相似，包含了大部分含硫指纹谱峰，与酱香型白酒相似度更高。图中的指纹谱峰标号为表2 中含硫化合物的序号。尽管绵柔型芝麻香白酒与酱香型白酒挥发性成分相似，但是含硫指纹谱色谱峰更加丰富，同时与其他香型的指纹谱峰相比，相同的指纹谱如3 号、6 号、8 号和13 号，绵柔型芝麻香中的含量和比例与其他3 种香型的白酒也不同。正是由于所含有的特征组分和含量的不同，导致绵柔型芝麻香白酒特殊的口感和功效。

表1 绵柔型芝麻香白酒主要风味成分分析表 (mg/L)

表2 绵柔型芝麻香白酒挥发性含硫组分表

图2 不同香型白酒挥发性化合物指纹图谱比较

2.4.3 萜烯类化合物和吡嗪类化合物

萜烯类化合物既是构成白酒香气特征的一类重要香气化合物，也是白酒中重要的生理活性物质，同时作为功能性组分，具有较强的抑菌活性和抗凝血活性[8]。吡嗪类化合物是白酒中含氮化合物的主要成分，同时也是白酒香气成分的重要组成物质，虽然吡嗪类化合物在白酒中含量甚微，但它具有预防心血管疾病作用，对白酒的保健功能起着重要作用[9-10]。本文对绵柔型芝麻香白酒中的烯萜类和吡嗪类组分进行了定量分析，结果如图3 所示。从图3 可看出，古云烯、长叶烯、石竹烯、丁子香烯是构成绵柔型芝麻香白酒的主要烯萜成分，总含量为200 μ g/L。2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基、5-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和四甲基吡嗪为主要的吡嗪类化合物，总含量为328 μ g/L。