食物分离株细菌素RM1的特性及应用研究

张雪颖

摘 要：乳酸菌产生的细菌素由于其作为天然防腐剂和化学防腐剂的天然替代品而受到越来越多的关注。对从食物分离株RM1产生的细菌素（Ent-RM1）的特性及应用进行了研究，结果表明：筛选的细菌素 Ent-RM1具有较高的热稳定性和较宽的pH稳定性，对蛋白酶K敏感。用16%的三-三甲基十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，Ent-RM1的分子量约为4.0k～4.5kDa。硫酸铵沉淀法提取的 Ent-RM1（44.7 IU/mL Nisin当量）对接种到牛乳中的单核细胞增生李斯特菌 Scott A有杀菌作用，对蜡状芽孢杆菌ATCC 11778具有抑菌作用。在磷酸盐缓冲液与高压处理联合作用，Ent-RM1对大肠杆菌K12表现出协同灭活作用，表明Ent-RM1对控制食品工业中的细菌污染具有实际应用价值。

关键词：食物分离株细菌素Ent-RM1;热稳定;耐酸;杀菌;灭菌

肠球菌是温血动物胃肠道内的正常菌群，由于其GRAS（Generally Recognized as Safe）特性而被广泛用于食品工业[1-2]。在多种食物中均可分离到肠球菌，包括牛奶[3]、蔬菜[4]，奶酪[5-7]和香肠[8]等发酵食品。由于其蛋白水解、脂解酶活性和柠檬酸盐利用等特征，肠球菌在其他奶酪的成熟和香气发展中起重要作用。肠球菌已成功用作奶酪中的起子或辅助培养物，包括用于食品和其他膳食补充剂[9]。 目前细菌素作为食品防腐剂的应用主要集中在乳酸菌，包括乳球菌、乳酸杆菌、小球菌、明串珠菌产生的细菌素。有关肠球菌产生的细菌素在食品中的应用研究较少。肠球菌产生的细菌素通常称为肠球菌素，可抑制一些食源性病原体，如单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、肉毒梭菌、分枝杆菌、大肠埃希菌和粘球菌[10-13]的生长。考虑到特定的肠毒素可能具有独特的特性和抗菌潜力，分离新的细菌素将是十分必要的。本研究从不同食品中筛选产生肠毒素的肠球菌，为其在食品保鲜中的潜在应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 指示菌株和生长条件

植物乳杆菌ATCC 8014作为指示菌进行食物分离株筛选，存储于20%甘油的Lactobacilli DeMann，Rogosa and Sharpe （MRS）肉汤，-80℃备用。平板划线法接种指示菌在MRS琼脂板并于30℃温育过夜。单个菌落接种到MRS肉汤中，30℃温育过夜。所得培养物用于接种软琼脂覆盖物（0.75%）以检测细菌素活性。

1.2 产细菌素的食物分离株的筛选

选择乳制品、香肠、水果、发酵橄榄、生肉和生牛乳等19种不同的食品，采用软琼脂覆盖法筛选细菌素产生菌[14]。0.1%蛋白胨水与食物以1∶10（w/v）系列稀释，将系列稀释液涂布在MRS琼脂平板上，30℃下培养48h;制备指示菌。10mL的MRS软琼脂覆盖在约有100个菌落的平板，30℃下培养24h，周围有明显的抑菌区的菌落被认为是潜在的细菌素产生者。这些菌落在MRS琼脂上分离，同时检测革兰氏反应和细胞形态，存储于20%甘油中-80℃备用。

1.3 抗微生物活性测定

草坪斑点试验[14]用于确定细菌素。过夜培养的分离株培养液离心（8 000×g、4℃、10 min），获得无细胞上清液。10μL上清液涂布于MRS软琼脂平板上，30℃培养18h，观察抑制区的出现。为了排除噬菌体的可能性，从抑制区无菌切出一片琼脂，0.1%蛋白胨水匀浆与MRS软琼脂混合，将其与指示菌隔夜培养混合，倒入培养皿，检测噬菌斑的存在。

1.4 抗菌谱

所有食物分离株均接种于5 mL MRS肉汤中，30℃培养24h。其他革兰氏阳性菌和革兰阴性菌接种到5mL的肉汤中，37℃培养24h。10μL无细胞上清液（调节pH值6.5～7.0），点至过夜培养的软琼脂上，30℃培养24h，并记录抑菌活性。共有14株广谱抗菌活性的菌株被检出，其中一株命名为RM1，其产生的细菌素命名为 Ent-RM1，由于其具有最广谱的抗菌活性而被选出进行下一步研究。

1.5 食物分离株的鉴定

根据16SrRNA基因序列分析鉴定食物分离株的种属。使用DNA分离试剂盒（（DNeasy Tissue Kit）提取分离株的总DNA。通用寡核苷酸引物fD1（5-CCG AAT TCG TCG ACA ACA GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3）和rD1 （5-CCC GGG ATC CAA GCT TAA GGA GGT GAT CCA GCC-3）扩增16SrRNA基因[15]。Taq DNA聚合酶试剂盒（QIAGEN）用于聚合酶链扩增反应（PCR）。PCR反应包括初始变性（在95℃下3min），30个变性循环（95℃ 1min）后、退火（52℃ 30s）和延伸（72℃ 2min），最后延伸（72℃ 10min）。所有的PCR反應均在Techgene DNA热循环仪中进行。PCR产物经DNA提取试剂盒（QIAGEN）纯化，连接到pGEM-T Easy 载体中（Promega Corporation），化学转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。二氧化硅旋转柱（QIAGEN）从含氨苄青霉素（100mg/mL）的LB（Luria-Bertani）肉汤中过夜培养获得重组质粒。用非限制性内切酶Not I（New England Biolabs）消化重组质粒。另外，使用T7终止子和SP6启动子引物，通过Plant and Microbe Genomics Facility对插入的DNA片段进行测序。使用BLAST工具将获得的基因序列与NCBI GenBank中的已知细菌序列进行比较。最终的种属鉴定仅基于具有97%最小相似性的最高得分查询来实现。

1.6 细菌素活性鉴定

以1∶10将MRS软琼脂接种到指示菌隔夜培养物中，倒入培养皿，25°C放置10 min，再从指示培养琼脂中切出直径为4 mm的孔。在0.1%蛋白胨水中制备了RM1无细胞上清液的2倍稀释液，将其置于琼脂井孔中（50mL）。无菌0.1%蛋白胨水作为对照组。30℃下隔夜培养，测量并记录井壁周围的抑制区。以显示指示剂草坪的清晰抑制区的最高稀释度的倒数，乘以因子20以获得AU / mL的任意活性单位测量细菌素滴度[10]。

1.7 酶和热处理的影响

过夜培养的分离株RM1无细胞上清液（1mL）用以下酶（终浓度1μg/ mL）37℃处理2h：在20mmol/L Tris-HCl中的α-胰凝乳蛋白酶，pH 8.0;胃蛋白酶在0.002N HCl中;脂肪酶在0.1mmol/L磷酸钾中，pH 6.0;木瓜蛋白酶在0.05mmol/L磷酸钠中，pH 7.0;胰蛋白酶在40mmol/L Tris-HCl中，pH 8.2;蛋白酶在20mmol/L Tris-HCl中，pH 7.8;蛋白酶K和无花果苷在20mmol/L磷酸钠，pH 7.0中。未经处理的无细胞上清液作为阳性对照。草坪斑点法测定Ent-RM1经热处理后的活性，即RM1无细胞上清液（1mL）在100℃静置5、10、30min后，观察其活性。

1.8 不同pH值下的稳定性

用1mmol/L HCl或1mmol/L NaOH调节无细胞上清液的pH值，室温下培养1h，再将上清液调至中性pH值，用草坪斑点试验测定Een-RM1在不同pH值（pH 3.0、7.0、9.0）下的稳定性。未调节pH值的无细胞上清液为对照。

1.9 Ent-RM1粗提

分离株RM1隔夜培养液5mL转至1 000 mL新鲜MRS肉汤中，30℃培养24h，4℃离心（12 000×g，15 min）后，硫酸铵加入无细胞上清液中至60%的饱和，4℃温和搅拌过夜。经4℃离心（12 000×g，30 min）后，悬浮于50 mL磷酸钾缓冲液（PBS，50mmol/L，pH 6.5）中。在4℃下，用1 kDa截留膜透析管对1 000 mL磷酸钾缓冲液（100 mm，pH 7.0）进行透析，共4次。命名为CE-RM1剩余的溶液（∽20 mL）通过0.2mm孔径的低蛋白结合滤器（Millipore Corp.）灭菌，-20℃储存备用。

1.10 CE-RM1的活性量化

以商品Nisin为标准，测定CE-RM1的相对活性[10]。Nisin溶于蒸馏水（目标浓度为1 000 IU/mL），1mol/L HCl调节到pH 2.0，在121 oC灭菌15 min。将浓度分别为100、50、12.5、6.25、3.13 IU/mL的Nisin （5mL）接种于63孔MSR软琼脂上。同时点样5μL CE-RM1，30℃下培养24h，观察抑制区并测量其直径，构建剂量反应图，用以确定CE-RM1的Nisin等效单位。

1.11 分子量评估

采用16%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），对 Ent-RM1的分子量进行了初步分析评估。使用预染色的低范围分子量蛋白质标记物作为大小参考[16]。10μL CE-RM1加载到凝胶上，电泳后分离这两组泳道。通过用考马斯蓝固定和染色，一半凝胶用于分子量测定。另一半通过在20%（v / v）异丙醇和10%（v / v）乙酸中连续固定（30min/次），蒸馏水中洗涤，并室温保持过夜，测定抗微生物活性，即用MRS软琼脂覆盖洗过的凝胶，30℃下培养18h，观察蛋白质条带周围抑制区。

1.12 CE-RM1在牛乳中的抗菌性能

在市售灭菌牛乳中接种单核细胞增生李斯科特ScottA和蜡样芽孢杆菌ATCC 121778检测以CE-RM1的抗菌性。在已经接种了致病菌（103 CFU/mL）的9mL牛乳中加入1mL CE-RM1，35oC培养24 h，同时以没有加CE-RM1的接种液作为对照。在选定的时间点，将接种的牛乳在0.1%蛋白胨水中连续稀释并涂布在TSA平板中，以确定CE-RM1对牛乳中病原体生长的影响。35℃温育24～48h以计数存活者（CFU/mL）。

1.13 超高压处理（HPP）和CE-RM1聯合作用对大肠杆菌K12的灭活

离心（12 000×g、4℃、10min）后收集静止期（109CFU / mL）的大肠杆菌K12细胞（25mL），25mL无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS，12.5mol/L，pH 7.2）洗涤2次，悬浮于25mL PBS中。将细胞悬液（900μL）与PBS（100μL）或CE-RM1（100μL）混合，无菌转移至无菌聚乙烯袋，热密封。在含有1∶1（v / v）乙二醇的高压处理器（Quintus QFP-6，Flow Pressure Systems）中将样品袋在500MPa和25±2℃下加压1min水压传输液（Houghto-Safe 620 TY）。此外，含有PBS（100μL）或CE-RM1（100μL）的样品用作对照，冰上备用。将所有样品在0.1%蛋白胨水中连续稀释并涂布在TSA上，37℃培养24～48h以计数存活者（CFU/mL）。该实验独立重复3次。

2 结果与分析

2.1 具有抗菌活性的分离物的分离和鉴定

共有51株菌被分离，这些从食品中分离的菌株均为非孢子革兰氏阳性球菌。其中14株分离菌株分别命名为 3E1、 3E2、 3E3、 3E4、 3E5、 3E6、5B1、6F2、6F3、15I2、16D1、16D2、B1和RM1，对食源性病原菌单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽孢杆菌具有抗菌活性（表1）。此外，使用草坪斑点试验法检测抗微生物特性，表征显示抑菌圈为细菌素的作用而非噬菌体所致。基于16S rRNA基因序列分析，这14株分离菌株均被鉴定为肠球菌属（Enterococcus spp.）。14株分离株产生的细菌素能够抑制单核细胞增生李斯特菌生长的能力。其中，具有最广谱的抗菌活性的分离株RM1被鉴定为粪肠球菌（Enterococcus faecalis），有研究报道，非食物系统中粪肠球菌的高流行率是各种食物中天然微生物群的普遍成员[1，17-18]。

2.2 Ent-RM1的特性

Ent-RM1对指示菌显示出强的抗菌滴度（1 280AU/ mL），其活性对热和各种酶处理的敏感性见表2。100℃处理10min后，Ent-RM1的抗微生物活性仍然保留，表明其相对热稳定性。但活性在100℃热处理20min完全消失。此外，Ent-RM1在很宽的pH内都很稳定。与Nisin不同，其溶解度和活性随pH值的增加而降低，直至活性完全消失[19]，Ent-RM1在室温下培养1h后在3.0～9.0的pH范围内仍保持其活性。Ent-RM1对蛋白酶K和α-胰凝乳蛋白酶敏感，表明其蛋白质特性，部分活性在胰蛋白酶处理下丢失，揭示其抑制作用的亚态的蛋白质性质。对脂肪酶的抗性表明Ent-RM1不需要脂质部分用于活性。综上所述，Ent-RM1可能是巴氏杀菌、酸性或碱性食品或食品中潜在的添加剂。由草坪斑点法及细胞上清液中产生的抗菌活性显示，Ent-RM1既可在固体培养基中产生，也可以在液体培养基中产生，原因是一方面细菌素在产生细菌素的菌株表面所必需的吸附作用;另一方面，产生菌与指示菌之间必须进行物理接触，才能诱导细菌素的产生。这些控制系统可以节省细菌细胞的能量。

2.3 Ent-RM1相对活性值

为了量化CE-RM1的活性，使用商业Nisin作为参考标准测定相对细菌活性值。由图1可知，测量CE- RM1的抑制区直径为16 mm，与标准剂量反应图中的类似点相匹配，确定CE-RM1的当量浓度为44.7 IU /mL。

2.4 Ent-RM1分子量评估

通过16%Tris-tricine SDS-PAGE分析，结果表明，Ent-RM1的分子量约为4.0k～4.5kDa（图2泳道C）。因为通过SDS-PAGE测定值是近似的，故该分子量是估计值。

2.5 食源性病原体的灭活

图3结果表明，处理1h后，单核细胞增生李斯特菌Scott A的群体降低至检测限（101CFU / mL）以下，显示Ent-RM1具有针对该病原体的杀菌作用（图3A）。CE-RM1抑制芽孢杆菌ATCC 11778生长的结果见图3B，在整个培养期间该病原体的没有明显生长，表明Ent-RM1具有针对蜡状芽孢杆菌的抑菌作用。

2.6 HPP与CE-RM1的协同效应

为了灭活革兰氏阴性细菌，用HPP和CE-RM1协同对大肠杆菌K12进行处理（图4）。用HPP单独处理或者CE-RM1单独处理大肠杆菌K12没有显著差异，表明单独的Ent-RM1对该革兰氏阴性细菌没有抗菌活性，可能是由于外膜的屏障特性[20]。虽然革兰氏阴性菌的膜转运蛋白孔蛋白允许600 Da以下的亲水分子自由扩散，但 Ent-RM1太大（4.0k～4.5 kDa），无法横穿外膜[12]，因此，Ent-RM1不能到达细胞质膜，大多数细菌素所攻击的靶标[7]。CE-RM1与HPP组合导致大肠杆菌K12明显失活，与对照（未经任何处理）相比平均群体减少5.5log，而仅由HPP引起3.0log减少，表明HPP和Ent-RM1有协同抗微生物的作用。由于革兰氏阴性菌的外膜被认为是由于HPP后外膜蛋白的变性而受损，因此，Ent-RM1可进入细胞质膜，导致细胞的致死性[11]。

3 结论

本研究中，51株可产生细菌素的细菌从不同的食物中分离出来。采用草坪班点法，对14株对食源性病原菌（单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽孢杆菌）具有抗性的食物分离株进行了鉴定。结果显示，这14株分离株均被鉴定为肠球菌属，其中从牛乳中分离出一株具有广谱抗菌活性并且具有很强的抗菌活性的菌株进行研究。通过16S rDNA测序将此新分离的食源性菌株鉴定为肠球菌（Enterococcus faecalis），并命名为菌株RM1，其产生的细菌素被命名为Ent-RM1。虽然肠球菌在奶酪中的使用备受争议，如南欧一些国家用肠球菌作为起子发酵奶利用的是肠球菌对奶酪风味的影响，而北欧一些国家却持反对意见，但一些研究表明，食物分离株肠球菌对于传统奶酪的成熟和香味的形成具有积极的作用[21]。同时，肠球菌能够抑制食源性病原菌，如李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、产气荚膜菌等的生长。细菌素的功效常受到食物生态系统中食物组成等条件的影响[22]。本研究对Ent-RM1在接种到牛乳中的食源性病原菌进行的抗性实验结果表明，肠球菌RM1对牛乳中的单核细胞增生李斯特菌具有快速殺菌活性，对蜡状芽孢杆菌具有抑菌作用;同时，Ent-RM1在高达100℃和较宽pH范围内具有稳定性，使其可以作为天然防腐剂或食品添加剂用于食品中控制细菌污染，以提高产品的保质期。

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（責任编辑 唐建敏）