高产吡嗪类物质芽孢杆菌在高温大曲中的应用研究

沈 毅，陈 波，张亚东，甘浪飞，谢 娟

（四川省古蔺郎酒厂有限公司，四川古蔺 646523）

众所周知“曲乃酒之骨”“好曲出好酒”“曲定酒型”，高温大曲是“酱酒”中酱香、曲香、焦香等典型香气特征的重要来源之一。吡嗪类物质是含有2个对称氮原子的六元杂环化合物，具有蒸汽压低、易挥发，且香势强、香味阈值低的特点，它主要由还原糖和游离氨基酸经细菌发酵和热处理而产生，是高温大曲中具有特殊香味的物质。研究表明[1]，酱香型白酒中的含量较高的吡嗪类物质主要集中于2-乙基-6-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪等，而2,3,5,6-四甲基吡嗪又是其中含量最高的。徐岩等[2]曾深入研究过白酒中四甲基吡嗪的来源及产生机制，并首次提出白酒中四甲基吡嗪的产生主要来源于微生物代谢反应。

微生物种类与数量直接影响高温大曲的风味物质组成，决定着酱香型白酒的品质。由于生料制曲过程的开放性、多酶多菌固态混合发酵体系的复杂多样性以及固态发酵难以监测调控等众多因素，常常影响酱香型高温大曲质量的稳定性。为改善和提高高温大曲品质，在发酵过程中添加纯种外源微生物已经成为一种广泛采用的手段，可以丰富大曲中微生物群系和维持特定微生物细胞浓度。本研究采用分离纯化、发酵筛选、形态结构鉴定等方法，从郎酒糖化堆糟醅中筛选出两株高产吡嗪类的地衣芽孢杆菌L8和枯草芽孢杆菌L17，将两菌株混合添加于麦料或稻草中，模拟高温大曲生产应用，以期提升高温大曲质量，为生产优质酱香型高温大曲奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

菌种：本研究所用菌株是从郎酒糖化堆中筛选出来的地衣芽孢杆菌L8、L17，按1∶1比例制成菌液待用。

原辅料：所用高温大曲、稻草等原辅料均来源于四川省古蔺郎酒厂有限公司。

试剂：所用试剂均为国产分析纯。

仪器设备：Stable Flex 纤维头（50/30 μ m DVB/Carboxen/PDMS）、57550-U 手动萃取手柄，美国Supelco 公司；7890A-5975C 气相色谱质谱联用仪，安捷伦科技有限公司；高精度电子分析天平，上海精科仪器有限公司；SCQ-2201系列超声波清洗机，上海声彦超声波仪器有限公司；TDL-50 台式低速离心机，常州梅香仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 高温大曲生产操作

小麦经过浸润，粉碎，再添加母曲5%，添加母曲后，将备好的混合菌液分别按0.1 ‰、0.5 ‰、1 ‰、2 ‰、5 ‰的比例添加至粉碎的麦料（50 kg/份）中（此为将菌液添加至粉碎的麦料组，简称“麦料组”），以未添加功能菌液的麦料3 份作为空白对照（简称“空白组”）。再模拟高温大曲工艺进行拌和水分，踩曲、安曲、翻曲、拆曲出仓等一系列操作。另选麦料中没有添加菌液的麦料3 份，将菌液添加至安曲过程使用的稻草中，按1‰接种比例添加至稻草中（此为将菌液添加至稻草中，简称“稻草组”）。其中混合菌液采用一种地衣芽孢杆菌和一种枯草芽孢杆菌按1∶1 比例混合而成，3 组操作同时进行，各组曲坯做好标记，具体要求如下：

将粉碎后的麦料搅拌均匀，再分成若干小堆，每堆准确称量至50 kg，根据要求分成“麦料组”“空白组”“稻草组”，同时拌和操作，“麦料组”添加不同比例菌液和适量水，“空白组”与“稻草组”只添加适量水，控制麦料拌和水分为39%，经过曲模制成大小相同的曲块，保证曲坯长、宽、高、曲包幅度一致，晾曲15 min，便统一进行安曲操作。其中“稻草组”在安曲时采用添加过1 ‰菌液的稻草，“空白组”“麦料组”的稻草需要添加同样数量的水。安曲时，在稻草使用数量，稻草厚度和使用方式相同的前提下，保证“麦料组”“空白组”“稻草组”在曲堆同一层，采用编织布隔离区分，并做好标记，培菌发酵40 d左右，前28 d每天对各组进行温度测量。

分别于第一次翻曲时、第二次翻曲时、出仓时立即取样，并测定各组曲坯的水分、酸度、糖化力、蛋白质、三甲基吡嗪和四甲基吡嗪含量。对第一次翻曲、第二次翻曲和出仓时各组曲坯进行顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction）结合GC-MS分析，同时对各组曲块进行感官鉴定。

1.2.2 曲坯中香味物质测定[3-5]

本研究香味物质主要以特征香味物质三甲基吡嗪、四甲基吡嗪为参考目标，采用顶空固相微萃取(HS-SPME)技术结合GC-MS分析曲坯中挥发性成分及吡嗪类物质的含量。

样品处理：取曲坯15 g，研磨充分后加入30 mL蒸馏水浸泡10 min，然后搅拌加超声波处理30 min，离心取上清液5 mL 于15 mL 萃取瓶中，加入2 g NaCl(酒样稀释10 倍，则直接取5 mL 于15 mL 萃取瓶中，不加NaCl)。插入装有2 cm-50/30μ m DVB/Carboxen/PDMS StableFlex 纤维头的手动进样器，在60 ℃左右顶空萃取45 min 取出，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口(温度250 ℃)中，热解析4 min进样。采用全扫描模式对曲坯中挥发性成分进行检测。

气相色谱条件：色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，柱温35 ℃(保持5 min)，以4 ℃/min升温至135 ℃，再以8 ℃/min升温至180 ℃保持5 min，运行时间43 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯氦(He，99.999%)；柱前压7.62 psi，载气流速0.8 mL/min；分流进样，分流比为20∶1；溶剂延迟时间2 min。

质谱条件：电子电离源(electron ionization，EI)，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃。

定性定量方法：采用选择离子扫描模式对三甲基吡嗪、四甲基吡嗪的4 个特征离子进行扫描。根据峰面积与含量成正比的关系，用GC-MS 联用仪计算其峰面积对应的响应值，根据已建立的四甲基吡嗪响应值-浓度标准曲线，得到曲坯中三甲基吡嗪、四甲基吡嗪含量。

1.2.3 曲坯糖化力、蛋白质、水分、酸度含量的测定

糖化力测定参照白酒生产技术全书中的糖化酶活力测定[6]；蛋白质测定参照国标GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》中的方法测定[7]；水分测定参照国标GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》中的方法测定[8]；酸度测定参照国标GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》中方法测定[9]。

2 结果与分析

2.1 添加方式对曲坯理化指标的影响

该实验分别对1‰菌液添加量的“麦料组”“空白组”“稻草组”在第一次翻曲、第二次翻曲及出仓时曲坯的理化指标（糖化力、蛋白质含量、水分、酸度、三甲基吡嗪含量、四甲基吡嗪含量）进行了测定，不同添加方式的理化指标见表1。

表1 不同菌液添加方式的理化指标

由表1 可知，其中“麦料组”“空白组”“稻草组”曲坯的同一阶段的水分与酸度相差不大。“麦料组”曲坯在30 ℃下第一次翻曲、第二次翻曲、出仓后糖化力分别为19 mg/g·h、50 mg/g·h、95 mg/g·h，对比“空白组”和“稻草组”，发现糖化力为出仓＞第二翻曲＞第一次翻曲。同等添加量下，同阶段发酵后曲坯的蛋白质消耗量、三甲基吡嗪与四甲基吡嗪生成量为“麦料组”＞“稻草组”＞“空白组”。“麦料组”曲坯中四甲基吡嗪含量为6.86 μ g/g，而“空白组”只有1.78 μ g/g，“稻草组”只有2.68 μ g/g。在高温大曲生产中，添加功能性微生物芽孢杆菌混合液，其特征香味物质的提升强度跟其添加的方法有着密不可分的联系，添加菌液在麦料中一是会很大程度地改变原有菌落结构状态，二是使曲坯在制作、晾曲、安曲堆积过程中功能性微生物大量繁殖和代谢，为生成大量香味及其前体物质提供可能。

图1 发酵仓内各组曲坯的温度变化图

从图1 可以看出，在发酵仓内前8 d，“麦料组”升温幅度较“空白组”“稻草组”大，升温速率快，挺温60 ℃以上时间长。第一次翻曲后，发酵9～12 d时，“麦料组”升温快，温度较另两组高。而制曲温度影响微生物种群、数量、生化反应、生物酶活力等，从而影响曲药发酵及风味物质的生成。高温使各种耐高温酶活力提高或正常发挥，大量提高生化反应速率；高温使美拉德、焦糖化等褐变反应正常进行；高温利于香味物质及其前体形成，如四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、3-羟基-2-丁酮（乙偶姻）、2，5-二甲基吡嗪、吡啶、糠醛等。

2.2 菌液添加量对曲坯理化指标的影响

该试验对“麦料组”使用不同比例（0.1 ‰、0.5‰、1‰、2‰、5‰）添加菌液，对曲坯在第一次翻曲、第二次翻曲及出仓时曲坯的理化指标（糖化力、蛋白质含量、水分、酸度、三甲基吡嗪含量、四甲基吡嗪含量）进行了测定，相关结果如图2。

图2 菌液添加量对“麦料组”曲坯中糖化力的影响

从图2 可以看出，在相同菌液添加量下，“麦料组”曲坯的糖化力为出仓＞第二次翻曲＞第一次翻曲。随着添加量的增加曲坯的糖化力逐渐增大，随着菌液量的增多，对曲坯自身微生物之间相互作用增强，微生物多样性高，提升了产糖化酶微生物种类，从而曲坯糖化能力增强。

图3 菌液添加量对“麦料组”曲坯中水分含量的影响

从图3 可以看出，在相同菌液添加量下，第一次翻曲、第二次翻曲至出仓时“麦料组”曲坯水分逐渐降低。曲坯正常发酵，微生物生长繁殖产能产热，将水分逐渐挥发与吸收，直到微生物活动减弱。而不同菌液添加量对“麦料组”曲坯中水分含量影响较小，水分含量很大程度与发酵仓温度、空气流动速率与曲坯间氧气含量等有直接关系。

图4 菌液添加量对“麦料组”曲坯中酸度的影响

从图4 可以看出，在相同菌液添加量下，各阶段“麦料组”曲坯酸度大小为第一次翻曲＞第二次翻曲＞出仓。随着菌液添加量的增加，当添加量为1 ‰时，曲坯酸度较高，一定的酸度利于小麦原料物质成分的分解，同时为合成酯类、吡嗪等香味物质提供物质基础与保障。但实际生产中对酸度也有控制，并非越高越好。酸度过高会不利于褐变反应的进行。适当的酸度有利于厌氧、兼性厌氧菌的生长繁殖和酶作用的发挥（淀粉酶、蛋白酶的pH 值为5±0.5），而从酱香型高温大曲分离得到大多芽孢杆菌均为兼性厌氧菌，如地衣芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等。因而控制发酵过程中曲坯在适宜的酸度范围显得尤为重要。

图5 菌液添加量对“麦料组”曲坯中蛋白质含量的影响

由图5 可知，“麦料组”发酵后半成品曲（出仓曲）中残留蛋白质含量随接种菌液的数量增加而总体呈下降趋势。在同样的菌液添加量时，出仓曲残留蛋白含量低于第一次翻曲和第二次翻曲。蛋白质减少可能与加入的芽孢杆菌液自身生长消耗及代谢利用部分蛋白质将其转化成氨基酸、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪等物质有关。研究发现，芽孢杆菌产生的中性蛋白酶与其他微生物产生的蛋白酶协同作用，能降解复杂蛋白质，对提升高温大曲的品质有积极作用。

图6 菌液添加量对“麦料组”曲坯中三甲基吡嗪含量的影响

由图6、图7 可知，第一次翻曲和第二次翻曲的曲坯中三甲基吡嗪和四甲基吡嗪含量都较低。从图7 可以看出，“麦料组”出仓后最低四甲基吡嗪含量为3.45 μ g/g，当添加量达到1 ‰时，其四甲基吡嗪含量达到最高值为6.86 μ g/g，是空白组1.78 μ g/g的3.85 倍。其次为5 ‰添加量的“麦料组”的四甲基吡嗪含量为6.37 μ g/g。而三甲基吡嗪含量变化规律同四甲基吡嗪相似，因而选择1‰添加量便可有效提升曲坯中吡嗪类香味物质含量。

图7 菌液添加量对“麦料组”曲坯中四甲基吡嗪含量的影响

2.3 接入功能菌后曲坯感官分析

各组出仓曲坯分别送于专业的曲药鉴定师进行暗评，评价方法参照《郎酒酱香型高温大曲半成品曲验收标准》，各组曲坯鉴评结果详见表2。

由表2 可以看出，“麦料组”的半成品曲坯的色泽和外观、香味、断面均优于“稻草组”“空白组”的曲坯。高温优质大曲一般为黄褐色，曲块干，表皮薄，有酱香曲香味，豉香浓郁，无异味，而“麦料组”曲坯便是如此。

表2 各组的半成品曲坯感官鉴定表

3 结论

本研究从糟醅中分离得到的芽孢杆菌，按比例混合制成菌液，模拟酱香型高温大曲生产工艺进行应用实验。结果表明，不同菌液添加量对曲坯发酵存在影响，发现“麦料组”菌液添加量为1‰时最佳，所得半成品曲坯中吡嗪类物质含量较高，是“空白组”的3.85 倍；菌液添加方式上，在麦料中直接添加所制的曲坯的特征香味物质含量、曲坯感官质量均优于稻草中添加。