副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其流行病学研究

丁文文，王 乐，李飞跃，李 健，廖成水，刘志军，薛 云，赵战勤*

(1.河南科技大学动物科技学院/ 兽医生物制品工程实验室，河南洛阳471023；2.河南科技大学医学技术与工程学院/ 微生物检验实验室，河南洛阳471023)

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是巴氏杆菌科一种革兰氏阴性的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖型菌，引起猪的副猪嗜血杆菌病，又称Glässer 病[1]。该病以多发性浆膜炎(胸膜炎、腹膜炎、心包炎)、关节炎、脑膜炎等为病变特征，临床表现为高热，食欲不振，跛行，呼吸困难等症状。该病呈世界性分布，已成为全球范围内危害养猪业的最主要细菌性传染病之一，给世界养猪业带来重大经济损失[2]。HPS 的血清型较多，按Kieletein-Rapp-Gabrielson (KRG)琼脂扩散试验或间接血凝试验(IHA)对HPS 进行血清分型，至少可以将其分为15 种血清型，但临床20 %以上的分离菌株无法定型[3-4]。在世界范围内，该菌以4 型和5 型为主要流行血清型，其次是13 型、14 型等，但其时空分布也有明显差异[5-7]。因此，及时掌握HPS 的流行病学分布和规律是防控该病的关键因素之一。

1992 年Kielstein 和Rapp-Gabrielson 建立的基于热稳定性抗原的琼脂扩散试验[4]和2003 年Del Rio等建立的IHA 分型方法[3]，被认为是HPS 分型的“黄金标准”，但这2 种方法仍有较多弊端，如部分分离株不能定型(20 %以上)，交叉反应较强(不易判定)，抗血清不易制备等[8]。2015 年，Kate 等在获得HPS 1 型～15 型荚膜合成基因的基础上，分析其特异性靶点，建立了HPS 的PCR 分型方法。该方法能够区分除5 型和12 型外的所有HPS 血清型，操作简单，能够对100 %临床分离菌株定型(150/150)。

猪呼吸道传染病由细菌、病毒等多种因子引起，是目前规模化猪场中常见和引起较大经济损失的猪病症候群。在前期的研究中，本实验室分别报道了猪源多杀性巴氏杆菌和链球菌的病原流行病学情况及其分布规律[9-11]。本研究利用5 年时间，对河南及其周边省份猪群开展大规模HPS 的分离鉴定并对研究数据统计分析，系统掌握近年来HPS 的病原流行情况与规律、血清型分布，及其协同感染情况，为客观评估副猪嗜血杆菌病的危害及其综合防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株与实验材料 HPS 1 型～15 型参考菌株由澳大利亚昆士兰大学Blackall P J 教授惠赠；C 群马链球菌兽疫亚种C55156 株、大肠埃希菌C83-1 株、多杀性巴氏杆菌C44-1 株、猪霍乱沙门氏菌C78-1株、猪丹毒丝菌C43-6 株和猪胸膜肺炎放线杆菌S1536 株均购自中国兽医药品监察所菌种保藏中心；支气管败血波氏杆菌LY-1 株由本实验室保存。HPS 1 型～15 型标准阳性血清、HPS 5 型和12 型参考阳性血清和热稳定性抗原均由本实验室根据文献[12]所述方法制备；胰蛋白大豆琼脂(TSA)、胰蛋白大豆肉汤(TSB)购自美国BD 公司；新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司； NAD 购自美国Roche公司；基因组提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 病料样品采集与细菌分离 2445 份肺脏和不同数量的其它病料组织样品来自2013 年～2017 年河南省及其周边山西、湖北、安徽等省份的1024 个猪群，包括大、中、小型养殖场和各种类型的农村散养户，并对HPS 在不同年份和不同月份的分离率进行统计分析。发病猪多表现为精神不振、食欲减退、被毛凌乱、关节肿胀、跛行、皮肤及黏膜发绀甚至死亡等症状。为统计不同组织中HPS 的感染情况，本研究在采集肺脏(2445 份)的同时，部分猪采集心血(2341 份)、脑(313 份)、淋巴结(258 份)、肝脏(220 份)、脾脏(151 份)、关节液(470 份)等其它组织。将采集的病料样品划线接种于含新生牛血清(终浓度5 %)和NAD (终浓度10 μg/mL)的TSA 平皿，37 ℃培养24 h～48 h 后观察，挑取各种优势菌落传代纯化和革兰氏染色镜检。分离数据的统计基于以下原则：如果从同一病例不同病料组织样品中均分离到HPS，则只统计其中一个病料组织样品的分离菌株，分离优先次序为脑、心血、肺脏、淋巴结、脾脏、肝脏、关节液。

1.3 HPS 及其共感染菌的PCR 鉴定 本实验所用PCR 引物详见表1。按试剂盒说明书对疑似HPS、链球菌(Streptococcus，STR)、大肠埃希菌(Escherichia coli，EC)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，PM)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，BB)、沙门氏菌(Salmonella，SAL)和猪丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathia，ER)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)的分离菌株分别提取细菌的基因组为模板分别进行PCR 鉴定，鉴定为HPS 的菌株进一步用HPS 1 型～15 型特异性引物进行HPS 血清型的多重PCR 鉴定。PCR反应体系和反应条件按表1 中参考文献进行。

1.4 KRG 琼脂扩散试验 由于已经建立的PCR 分型方法不能将HPS 5 型和12 型区分开，所以进一步使用KRG 琼脂扩散试验对PCR 鉴定为5 型或12型的菌株进行5 型和12 型的血清型鉴定。方法如下：用生理盐水洗脱待鉴定的5 型和12 型的菌苔至已灭菌的西林瓶中，121 ℃高压处理2 h，10 000 r/min离心10 min，上清即为热稳定性抗原。KRG 琼脂扩散试验操作方法：用打孔器在琼脂平板上打孔，封底。中央孔加入HPS 阳性血清，周围孔加入无菌PBS 2 倍倍比稀释的待检菌株热稳定性抗原，以加满不溢出为宜，分别以制备的5 型和12 型阳性血清对应血清型的热稳定抗原作为阳性对照，以PBS 为阴性对照。放入湿盒中，置于37 ℃，24 h 后观察结果，应连续观察3 d。待检菌株抗原孔与阳性血清孔之间出现清晰白色沉淀线来判定血清型。

1.5 统计学分析 采用方差分析(ANOVA)对HPS在2013 年～2017 年间的年分离率和月分离率进行检验，p＜0.05 表示差异显著，p＜0.01 表示差异极显著。

2 结 果

2.1 HPS 的分离鉴定结果 通过细菌的分离鉴定，从采自不同省份的2445 份发病猪肺脏样品和其它病料组织样品中共分离出531 株HPS，总分离率为21.71 % (531/2445)。分离数据统计原则参照1.2。对其中的217 株HPS 采用PCR 方法进行血清型鉴定，结果显示，其中4 型最多，占28.57 %(62/217)；其次是5 型占17.51 % (38/217)、12 型占11.98 % (26/217)、13 型占8.29 % (18/217)、7 型占7.37 % (16/217)、14 型占5.53 % (12/217)、1 型占3.22 % (7/217)、2 型占3.22 % (7/217)；少数分离菌分别为3 型(2 株)、15 型(2 株)、8 型(1 株)、10 型(1株)、11 型(1 株)；未鉴定到6 型、9 型；另有24 株(11.06 %)未能鉴定出血清型(图1)。结果表明，4 型和5 型是最流行的HPS 血清型，与以往的报道相比14 型的分离率有所降低，而7 型的分离率明显增加，且已超过14 型。

2.2 HPS 在不同组织的分离结果 从发病猪不同组织器官分离的HPS 结果显示，肺脏的HPS 分离率最高，达21.51 % (526/2445)；其次是心血(18.75 %；439/2341)、脑(18.21 %；57/313)、淋巴结(9.30 %；24/258)、关节液(7.87 %；37/470)、肝(6.82 %；15/220)；脾的分离率最低(5.96 %；9/151)(图2)。结果表明HPS 最易导致呼吸系统感染，也可以进入血液循环系统造成全身性感染。

2.3 HPS 的流行特征分析结果 2013 年～2017 年5 年时间内，HPS 在河南及其周边省份的总分离率为21.71 % (531/2445)；不同年份的分离率介于18.12 %～30.31 % (图3)。HPS 在不同月份的分离率介于15.64%～29.66%。1 月份分离率最高(29.66%)，除5 月份外，随月份的增加分离率逐渐降低直到9月份的分离率最低(15.64 %)，之后随月份的增加分离率又逐渐上升直到12 月份(26.87%)。这些数据表明，HPS 的分离率具有明显的季节性；夏季(6 月、7 月、8 月)分离率最低，为16.67 %，冬季(12 月、1 月、2 月)分离率最高，为28.04 %，两者的分离率差异极显著(p＜0.01)(图4)。结果表明，1 月～12 月HPS 的分离率具有明显的季节性，冬季和春季HPS的分离率显著高于夏季和秋季。

表1 本试验所用PCR 引物Table 1 PCR primers used in this experiment

图1 217 株HPS 的血清型鉴定结果Fig.1 Identification of serotype of 217 H.parasuis isolates by PCR

图2 HPS 在不同组织的分离率Fig.2 Isolation rate of H.parasuis in different tissues

图3 HPS 在不同年份的分离率Fig.3 Isolation rates of H.parasuis between 2013-2017

图4 HPS 在不同月份的分离率Fig.4 Isolation rates of H.parasuis in different months between 2013-2017

2.4 HPS 共感染菌的分离鉴定及分析结果 在HPS 阳性的531 个病料样品中，有217 份仅分离出HPS，未发现其它主要致病菌，占40.87%(217/531)；另外314 份同时分离出了各种不同的共感染菌，占59.13 % (314/531)。最常见的共感染菌是链球菌，占所有共感染菌的40.76 % (128/314)，其次是大肠埃希菌占30.89 % (97/314)、多杀性巴氏杆菌占13.69 % (43/314)、支气管败血波氏杆菌占9.87 %(31/314)和沙门氏菌占4.45 % (14/314)、猪丹毒丝菌占3.49 % (11/314)、胸膜肺炎放线杆菌占2.10 %(6/314)(表2)。在314 份共感染病料样品中，有44份同时分离出3 种或3 种以上的共感染菌，占共感染病料样品的14.01 % (44/314)。表明临床猪群肺脏感染病原菌的种类较多且极其复杂。HPS 不仅与常见的呼吸道病原菌，如PM、BB 等共感染情况非常普遍，与其它常见病原菌的共感染情况也普遍存在。

3 讨 论

HPS 在不同国家和地区的流行情况有一定差异，如北美最流行的血清型是4 型、5 型、13 型、7 型[5]，西班牙是5 型、4 型、2 型、13 型[6]，巴西是4 型、14 型、5 型、13 型[7]等。本研究利用PCR 分型方法对我国河南及其周边省份近5 年分离的217 株HPS进行了鉴定，显示流行最广泛的是4 型，其次是5型、12 型、13 型、7 型和14 型，未分离到6 型和9型。与2005 年Cai 等[18]、2010 年Zhou 等[19]、2012年Zhang 等[20]的报道情况相比，近年来HPS 流行最广的仍然是4 型和5 型，但也发生了明显变化，如14 型的分离率有所降低，而7 型的分离率明显增加，且已超过14 型。目前的整体流行情况与2015年英国学者Kate 的报道比较一致[8]。本研究中仅有24 株(11.06 %)HPS 未能通过PCR 方法分型，但也显著降低了传统KRG 琼脂扩散分型方法和IHA 方法的不可分型比例(20 %以上)[3-4]。另外，分离结果还显示，不仅在发病动物的呼吸系统组织(如肺脏)分离到HPS，在发病猪的心血、脑、关节、淋巴结等组织中也能够分离到该菌，表明HPS 不仅能够感染呼吸道，而且也可以进入血液循环系统造成全身性感染。

本研究对2013 年～2017 年HPS 的时间分布情况进行了分析，不同年份HPS 的分离率介于18.12%～30.31 %，平均分离率为21.71 %。另外，HPS 的分离率具有明显的季节性；夏季(6 月、7 月、8 月)分离率最低，冬季(12 月、1 月、2 月)分离率最高，且两者差异极显著(p＜0.01)；冬季和春季HPS 的分离率显著高于夏季和秋季；这明显不同于本研究室前期报道的猪源PM 和STR 的流行情况及其季节分布规律[9-11]。猪源PM 的分离率也有明显的季节性，但有2 个高峰，分别为夏初(6 月)和冬初(12 月)[9]；猪源STR 的分离率在冬末(2 月份)和整个春季(3、4、5 月份)的分离率较高，另外在8 月也有一个小高峰[10-11]；这可能是因为其对猪具有不同的发病机理以及对环境的抵抗力不同而导致的。

表2 HPS 协同感染菌的分离结果及时间分布Table 2 Isolation of pathogenic bacteria in detected samples co-infected with H.parasuis

目前，猪呼吸道传染病是规模化猪场中危害最大的疾病症候群，可以由细菌、病毒等多种病原引起。HPS 是猪上呼吸道的一种共栖菌，在猪抵抗力较低的情况下侵入机体致病。同时，HPS 与其它病原的混合感染情况非常普遍，因为其与多种细菌或病毒具有协同致病作用，如BB、STR、猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒2 型等[10,21-22]。本研究中，531 份分离出HPS 的病料样品中，314 份(59.13 %)为HPS 与其它病原菌混合感染；最常见的共感染菌是STR，其次是EC、PM、BB 等，而分离到3 种或3 种以上共感染菌的比例达到14.01 %。表明在猪群中，HPS 与其它病原菌的共感染情况非常普遍。

本研究利用5 年时间开展大规模HPS 的分离鉴定和流行病学统计分析，结果显示其在猪群中的主要流行血清型为4 型、5 型、12 型、13 型、7 型、14 型，该病原的流行具有明显的季节性，且与其它病原菌的共感染情况非常普遍。本研究为客观评估副猪嗜血杆菌病的危害及其高效疫苗，特别是多价疫苗和多联疫苗的研发提供了实验依据。