一例混合感染猪病病原的实验室检测

李 斌，秦毅斌，卢冰霞，何 颖，段群棚，梁家幸，陈忠伟，周英宁，蒋冬福，卢敬专，全琛宇，许心婷，赵 硕，杨思仪，赵 平，3，赵 武

（1.广西兽医研究所，广西 南宁 530001；2.广西兽医生物技术重点实验室，广西 南宁 530001；3.广西大学，广西 南宁 530004）

2018年5月，广西某县某猪场突然有70多头35日龄猪发病，病猪症状为消瘦、腹泻、气喘、腹式呼吸，其中20多头猪病死。病死猪剖检病变为淋巴结肿大、出血；肺充血、出血，与胸膜粘连；肝充血；脾有梗死点；肾充血，表面有散在的出血点；膀胱黏膜有散在的出血点。应用抗生素对病猪进行治疗无效。该猪场将其中5头病死猪每头分别采取淋巴结、肺、肝、脾、肾等病料送实验室检测。据该猪场人员反映的病猪发病情况及病猪剖检病变，初步怀疑该猪场所发疫病病原为猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪肺炎支原体（MHP），于是应用本实验室所建立的PCR/RT-PCR方法对送检病料进行上述疑似猪病病原的检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料样品 将该猪场送检的5头病死猪的淋巴结、肺、肝、脾、肾等脏器分别混合研磨，依次编号为1、2、3、4、5。

1.1.2 试验试剂 AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司；HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；Golden Easy PCR System（含染料，双组份）购自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker DL 2 000购自Takara生物技术有限公司。

1.1.3 试验仪器 杭州晶格T960梯度PCR仪；北京六一厂电泳仪。

1.1.4 检测用PCR引物 检测所用PCR引物见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，均用ddH2O配制成25 µmol/L工作浓度。

表1 检测所用的PCR引物

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 分别剪取送检5份病料的淋巴结、肺、肝、脾、肾的病变与正常交界部分，将每头病死猪的这5种器官病料混作1份样品进行检测，共检测5份样品。将样品充分研磨，冻融3次，10 000 r/min离心3 min，取上清液备用。

1.2.2 检测样品核酸的提取 取上述处理好的样品离心上清液200 µL，按照RNA/DNA提取试剂盒说明书操作步骤，进行病毒核酸的提取，所得病毒核酸供RT或PCR检测用。其中，应用RT-PCR方法检测CSFV、PRRSV；应用PCR方法检测PCV2、PRV、MHP。

1.2.3 反转录（RT）

（1）RT反应体系。将样品RNA反转录合成cDAN：按照HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒说明进行，采用20 µL反应体系：5×RT Buffer 4 µL，dNTP Mix（2.5 mmol/L each）4 µL，DTT（0.1 M）2 µL，Primer Mix 2 µL，HiFiScript（200 U/µL）1 µL，RNA模板7 µL。

（2）RT反应反应条件。按以下程序进行反转录反应：42 ℃ 50 min，4 ℃保存。

1.2.4 PCR反应 应用PCR检测引物（上游引物F、下游引物R）分别对病料样品核酸进行5种病原的PCR扩增反应，这5种病原PCR扩增反应同时在同一台梯度PCR仪上进行不同退火温度的扩增反应。

（1）PCR反应体系。25 µL PCR反应体系为：双蒸H2O 9 µL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 µL，上、下游引物（F、R）各0.5 µL，DNA模板2.5 µL。

（2）PCR反应条件。94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，梯度退火温度：PCV2 56 ℃/CSFV 55 ℃/PRRSV 57 ℃/PRV 63 ℃/MHP 56 ℃，复性45 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.5 电泳观察结果 多重PCR反应结束，取10 µL多重PCR扩增产物于10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束于凝胶成像系统中观察结果，并拍照保存。

2 结果与分析

2.1 PCR产物电泳结果

PCR产物电泳结果见图1。

图1 部分病料样品及对照检测结果

2.2 送检病料5种病原的检测结果

在检测的5份病料样品中，CSFV、PRRSV二重感染率为60%（3/5），PCV2、CSFV、PRRSV三重感染率为20%（1/5），见表2。

表2 5份病料检测5种病原的检测结果

3 讨论与分析

3.1 本次检测针对不同的DNA/RNA病原，应用DNA/RNA核酸抽提试剂盒一次同时提取病料样品的总核酸（DNA/RNA）；应用相同的PCR/RT反应体系；应用除了不同病原对应不同退火温度之外，其余均相同的PCR反应条件。这种方便快捷的核酸提取方法及梯度退火温度PCR检测方法非常适合兽医临床病料样品中多种病原混合感染的快速检测。这种在同一台梯度PCR仪上应用不同退火温度同时扩增检测多种病原核酸的PCR检测方法，较之在同一PCR反应管中应用不同引物的多重PCR检测方法要简便易行，方法设计、优化难度低[1-2]。

本次检测针对P CV2、C SF V、PR R SV、PRV、MHP这5种常见猪病病原分别设计合成5对P CR扩增引物，根据5对引物不同的退火温度，在同一台梯度PCR仪上同时进行5份送检病料中的5种病原共25个样品的检测，结果检测出二重感染（CSFV+PRRSV）、三重感染（PCV2+CSFV+PRRSV）的病料。

3.2 本次检测的5份病料样品中，CSFV、PRRSV二重感染率为60%（3/5），PCV2、CSFV、PRRSV三重感染率为20%（1/5），说明该送检猪场猪只存在混合感染情况。目前猪病多发，其中混合感染病例较为常见，尤其是PCV2、CSFV、PRRSV等常见病原混合感染的猪病时有报道[3-9]。所以在防制单一猪病的同时要注意多重混合感染猪病的防制，猪场要应用多种疫苗或多联疫苗对多种猪病进行同时免疫预防。

3.3 根据检测结果，建议送检猪场采取如下防制措施：1）PCV2、PRRS均为猪免疫抑制性疫病，若发生这两种猪病，将会破坏病猪的免疫系统，导致免疫功能障碍，致使病猪机体免疫系统对疫苗的免疫应答反应水平下降，从而导致疫苗的免疫保护效果不理想，例如，猪只免疫力低下，造成免疫过的猪群发生非典型猪瘟[10]。这对猪场的危害尤为严重，所以要重点加强对PCV2、PRRS这两种猪免疫抑制性疫病的监测与防控。2）本次检测所用PRRSV引物根据PRRSV的Nsp基因设计，可以鉴别区分PRRSV经典毒株（预期扩增片段大小为320 bp）和PRRSV高致病变异毒株（预期扩增片段大小为230 bp），此次所检病料样品的PRRSV PCR扩增产物大小为230 bp，所以可以推断该送检猪场所发PRRS疫病是由PRRSV高致病变异毒株导致的。我国已发现PRRSV Nsp2的变异主要表现在氨基酸的缺失[11-14]，此次发现的高致病性猪繁殖与呼吸综合征就是由Nsp2缺失30个氨基酸的变异株引起的。PRRSV的基因容易发生变异，从而导致疫苗免疫失败，所以建议送检猪场对本场病猪的PRRSV进行基因测序，然后将测序结果序列与NCBI GenBank网站上的PRRSV参考毒株的相应基因序列进行遗传进化同源性比对，然后选择同源性最为接近的厂家PRRSV毒株疫苗进行免疫，以确保疫苗免疫的有效性。