猫杯状病毒抗体间接ELISA 检测方法的建立

孟凯闻,朱文壮,张 迪,金艺鹏,林德贵,孟 赓

(中国农业大学动物医学院,北京 海淀100193)

猫杯状病毒(FCV)是猫科动物的常见病原,可通过口、鼻等途径感染,主要在口腔和呼吸道组织中增殖,FCV 的单独感染或与其他病原的混合感染可引起猫的上呼吸道和口腔病变,临床见打喷嚏、眼鼻部出血、结膜炎、口炎、牙龈炎、口腔溃疡,严重者还会发生肺炎、跛行、流产、慢性胃肠炎、皮肤水肿及溃疡等[1-3]。其中猫口炎是临床中的常见口腔疾病,已有很多外国的报道揭示了猫口炎与FCV 的高度关联性,近年在北京地区的流行病学调查也证明了这一点[4-7]。FCV 与猫疱疹病毒等感染引起的症状非常相似,也可引起很多复杂的非典型症状,单从临床症状难以确诊病原,还需结合实验室诊断确诊。目前针对FCV 的实验室诊断包括病毒分离、核酸检测和血清学检测。本研究将原核表达的FCV-VP1 蛋白作为包被抗原,建立检测血清中FCV 抗体的间接ELISA 检测方法。

1 材料与方法

1.1 重组表达质粒、细胞、血清及试剂 重组表达质粒pET28a-FCV-VP1;感受态细胞BL21(DE3);96份临床血清由中国农业大学动物医院、美联众合伴侣动物医院、北京思诚动物医院、北京健爱缘动物医院、北京和谐动物医院、北京天照爱宠动物医院、北京星辉动物医院提供,由本实验室-80 ℃保存;HRP 标记兔抗猫IgG 购自北京博尔西科技有限公司。

1.2 FCV-VP1 抗原的制备 按常规方法将构建的FCV-VP1 重组表达质粒转化感受态细胞BL21(DE3);将重组表达菌株37 ℃培养,并用IPTG 诱导表达,将表达的重组蛋白利用HisTrap HP 亲和柱纯化。

1.3 间接ELISA 条件优化 基本步骤如下:将纯化的FCV-VP1 重组蛋白1 μg/mL 4 ℃过夜包被96孔酶标板,PBST 洗板3 次,加封闭液37 ℃封闭2 h,PBST 洗板3 次;加入血清稀释液100 倍稀释的待检血清,37 ℃作用30 min,PBST 洗板3 次,加入酶标二抗稀释液稀释的HRP 标记兔抗猫IgG,37 ℃作用30 min,PBST 洗板3 次,每孔加入100 μL TMB 底物溶液37 ℃显色10 min,用50 μL 2 mol/L 的硫酸终止反应,酶标仪读取各孔OD450nm值,计算阳性与阴性血清OD450nm值之比(P/N)。应用棋盘法确定各最佳条件。

1.3.1 最佳封闭液的确定以1 μg/mL 的抗原浓度,100 μL/孔包被96 孔酶标板,分别以1%BSA、0.05%OVA、1%明胶、5%胎牛血清、5%脱脂奶粉作封闭液,37 ℃封闭2 h,FCV 阳性血清作为一抗,同时设置阴性对照,加入HRP 标记兔抗猫IgG,进行常规ELISA 检测,酶标仪读取各孔OD450nm值,计算P/N 值,确定最佳封闭液。

1.3.2 最佳血清稀释液的确定将样本血清分别以1%BSA、PBST、5%兔血请、5%胎牛血清按1∶100 稀释,100 μL/孔加入96 孔酶标板反应,进行常规ELISA 检测,酶标仪读取各孔OD450nm值,计算P/N值,确定最佳血清稀释液。

1.3.3 最佳酶标二抗稀释液的确定将HRP 标记兔抗猫IgG 以1%BSA、PBST、5%兔血请、5%胎牛血清稀释至效价为1∶10 000,进行常规ELISA 检测,酶标仪读取各孔OD450nm值,计算P/N 值,确定最佳酶标二抗稀释液。

1.3.4 最佳酶标二抗工作效价的确定以筛选的最佳酶标二抗稀释液稀释HRP 标记兔抗猫IgG 至效价为1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000,设置2 个重复,进行常规ELISA 检测,酶标仪读取各孔OD450nm值,计算P/N 值,确定最佳酶标二抗工作效价。

1.3.5 临界值的确定对本实验室保存的32 份FCV阴性血清样本,以本实验室建立的间接ELISA 抗体检测方法进行检测,计算样本OD450nm值的平均值(X)和标准差(SD)。根据统计学,当样本OD450nm值≥X+3SD 时,判定为阳性。

1.4 间接ELISA 方法的特异性 按照上述建立的ELISA 方法,用同一批次的ELISA 检测板对FCV 阳性血清及猫泛白细胞减少症病毒(Feline Panleukopenia Virus,FPV)、猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritionitis Virus,FIPV)、猫白血病病毒(Feline Leukemia Virus,FeLV)、猫免疫缺陷病毒(Feline Immunodefiency Virus,FIV)的阳性血清进行特异性检测。

1.5 间接ELISA 方法的重复性 批内重复性试验:按照上述建立的ELISA 方法,用同一批次的ELISA 检测板测定8 份FCV 阳性血清,每份血清做3 孔平行,对结果进行统计学分析,评估间接ELISA方法的批内重复性。

批间重复性试验:应用3 个不同批次制备的ELISA 检测板,测定8 份FCV 阳性血清,对结果进行统计学分析,评估间接ELISA 方法的批间重复性。

1.6 临床猫血清的检测结果 按照上述建立的ELISA 方法,对96 份临床收集的猫血清进行检测。

2 结果

2.1 最佳封闭液的确定 以纯化的重组蛋白FCVVP1 1 μg/mL 4 ℃过夜包被酶标板,分别以1%BSA、0.05%OVA、1%明胶、5%胎牛血清、5%脱脂奶粉作封闭液,进行ELISA 检测,结果显示(表1),当用5%脱脂奶粉封闭时,P/N 值最高,因此选择5%脱脂奶粉为最佳封闭液。

2.2 最佳血清稀释液的确定 将样本血清分别以1%BSA、PBST、5%兔血清、5%胎牛血清按1∶100 稀释,进行ELISA 检测,结果显示(表2),当用5%胎牛血清稀释时,P/N 值最高,因此选择5%胎牛血清为最佳血清稀释液。

2.3 最佳酶标二抗稀释液的确定 以1%BSA、PBST、5%兔血清、5%胎牛血清分别稀释HRP 标记兔抗猫IgG,进行ELISA 检测,结果显示(表3),当用5%兔血清作为酶标二抗稀释液时,P/N值最高,因此选择5%兔血清为最佳酶标二抗稀释液。

2.4 最佳酶标二抗工作效价的确定 以5%兔血清稀释HRP 标记兔抗猫IgG 至效价为1 ∶10 000、1∶15 000、1∶20 000,进行ELISA 检测,结果显示(表4),当效价为1 ∶20 000 时P/N 值最高,因此选择1∶20 000为最佳酶标二抗工作效价。

2.5 临界值的确定 对本实验室保存的32 份FCV阴性血清样本,进行检测,结果显示(见表5),样本OD450nm值的平均值()为0.068,标准差(SD)为0.031,因此临界值为+3SD=0.161,即当样本OD450nm值≥0.161 时判为阳性。

2.6 间接ELISA 方法的特异性 用上述建立的间接ELISA 方法分别对FPV、FIPV、FeLV、FIV 和FCV的阳性血清进行测定,其OD450nm值分别为0.096、0.103、0.074、0.105、1.189,除FCV 阳性血清外,其他病毒的阳性血清OD450nm值均小于临界值0.161,表明建立的间接ELISA 方法特异性良好。

2.7 间接ELISA 方法的重复性 重复性试验表明,批内重复试验变异系数均值为4.33%(表6),批间重复实验变异系数均值为5.75%(表7)。通过试验表明,建立的间接ELISA 方法重复性及稳定性良好。

2.8 临床猫血清的检测结果 用本实验室建立的检测方法对96 份临床收集的猫血清进行检测,ELISA 检测结果表明(表8),全部血清样本中共检测出40 份阳性血清,猫口炎就诊病例阳性率为96.3%(26/27),猫口炎无关病例阳性率20.3%(14/69)。

表1 最佳封闭液的确定

表2 最佳血清稀释液的确定

表3 最佳酶标二抗稀释液的确定

表4 最佳酶标二抗工作效价的确定

表5 临界值的确定

表6 间接ELISA 批内重复试验结果

表7 间接ELISA 批间重复试验结果

表8 临床血清样本的检测结果

3 讨论

FCV 在临床上可引起猫科动物口炎,导致患猫流涎、口腔黏膜红肿溃烂、口臭、进食困难,进而厌食消瘦,极大地影响了家养宠物猫及流浪猫的生活质量。针对FCV 的检测,由于FCV RNA 依赖的RNA 多聚酶缺少校正功能及低保真性,使得病毒的基因组有很高的重塑性极易发生抗原变异,这为临床上检测FCV 造成了极大困难[1-2]。目前除了常规的RT-PCR 检测方法,尚无针对FCV 可用的血清学商品化快速检测试剂盒或检测卡。

FCV 衣壳蛋白VP1 分为NTA、S、P1、P2 等结构域,其编码基因具有高度保守性,其中病毒颗粒最外表面的P2 结构域是大多数中和表位所在的区域,因此可作为疫苗及检测试剂盒制备中的首选蛋白[8]。本试验利用已构建的重组质粒pET28a-FCVVP1,通过原核表达获取FCV-VP1 重组蛋白,以该蛋白作为包被抗原建立了FCV 间接ELISA 抗体检测方法,经检验具有良好的特异性,操作简便,可重复性高。

利用本试验建立的ELISA 方法检测临床收集的96 份猫血清,结果表明,其中40 份呈阳性,猫口炎就诊病例阳性率为96.3%(26/27),猫口炎无关病例阳性率20.3%(14/69),该结果与此前报道的猫杯状病毒与猫口炎的高度关联性相符合。

本试验成功建立了以原核表达的FCV-VP1 蛋白为基础的FCV 间接ELISA 抗体检测方法,具有广泛的应用前景。