薄膜过滤法在中药常山散微生物限度检查中的应用研究

王 玲,郭志廷,杨 峰,魏小娟,李宏胜,周绪正,刘龙海

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃 兰州730050)

中药常山(Dichroa febrifuga Lour.)为目前国内常用的抗球虫中药材,可单独使用或以复方制剂的主药用于抗球虫治疗药物[1]。常山散口服制剂是通过现代中药分离技术,提取常山生药根中的有效活性成分常山总生物碱制得,可用于防控鸡球虫病。口服制剂中微生物污染状况的控制是药品质量控制的重要指标,而中药口服制剂因药材来源及生产工艺的特殊性,尤其易受到微生物的污染。薄膜过滤法是对细菌微生物量测试的有效方法,同时也是微生物限度检验中的方法之一[2],该法在无菌检查中可以快速集菌,在药品微生物限度检查中可以去除药品中某些成分的抑菌作用。同时,也可作为制药微生物回收和医药制剂中微生物验证的一种试验验证方法,所以薄膜过滤法在药品检验中的应用越来越被重视。为保证检验结果的真实性、有效性,在进行常山散的微生物限度检查时需先考虑去除药物有可能存在的的抑菌活性,以使回收率达到要求。故应从供试液的制备、取样量、冲洗液的体积、滤膜的选用等方面进行考察,采用适当的方法消除口服散剂中有可能存在的抑菌活性,再对常山散进行微生物限度的检查。因目前尚未见有关中药常山散微生物限度检查方法的报道,本试验参照2010 版《中国兽药典》微生物限度检查法,对常山散进行细菌、真菌及酵母计数方法及加菌回收率的建立和验证,对中药提取物常山散的质量控制、研发和申报抗球虫新兽药有着积极的现实意义。

1 材料与方法

1.1 供试药品 常山散(批号:20150725、20150812、20150822,河北正道生物科技有限公司生产)。供试液的制备:取常山散10 g,加pH 值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 mL,混匀,作为1∶10 的供试液。

1.2 培养基和缓冲液 营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、麦康凯琼脂培养基、哥伦比亚琼脂培养基,以上培养基由广东环凯微生物科技有限公司提供。胆盐乳糖培养基、胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、乳糖胆盐发酵培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基、溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基、绿脓菌素测定用培养基、亚碲酸盐肉汤培养基、卵黄氯化钠琼脂培养基、梭菌增菌培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基、念珠菌显色培养基,上述培养基由青岛高科园海博生物技术有限公司提供。pH 值7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH 值7.2 无菌磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水,参照《中国兽药典》2010 版无菌检查法配制。所用试剂均为分析纯。

1.3 试验仪器 生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司,型号HPsafe-1200LC),隔水式培养箱(上海一恒科学仪器有限公司,型号GHP-9160),全温振荡培养箱(上海精宏实验设备有限公司,HZP-250);电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司,型号DHG-9240A);立式超低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司,型号DW-86L338);漩涡混合(美国SCILOGEX,MX-S);立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂,型号LDZX-30KBS);AP-01P 真空泵(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);薄膜过滤器(杭州泰林生物技术设备有限公司,孔径0.45 μm,直径50 mm)。

1.4 菌液制备、计数及菌液稀释度的确定 细菌、真菌和酵母计数及回收率测定,选用菌株为金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]。另生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]、乙型副伤寒沙门菌(B)[CMCC(B)50094]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104],用于方法验证试验、控制菌的检查及供试品的无菌检查。均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心,具有ATCC 官方授权。菌种要求不得超过5 代。

1.4.1 细菌组菌液 将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种至5 mL 营养肉汤中,在35 ℃~37 ℃下培养18~24 h,制得菌液。取上述菌液用0.9%无菌氯化钠溶液依次10 倍稀释至10-4~10-7稀释度,每个稀释度各吸取200 μL 菌液对号接种至不同稀释度编号的营养琼脂平板上(10-5~10-7稀释度各设2 个重复),将菌液在平板上涂布均匀,在35 ℃-37℃下倒置培养18~24 h,计数,以确定菌悬液浓度约为50~100 CFU/mL 的最佳稀释度。

1.4.2 真菌组菌液 将白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁液体培养基中,在27 ℃下培养24~28 h,制得菌液。取上述菌液用0.9%无菌氯化钠溶液依次10 倍稀释至10-4~10-6稀释度,分别吸取各稀释度菌液200 μL 接种至玫瑰红钠琼脂培养基平板或改良马丁琼脂培养基平板上,每个稀释度2个重复,将菌液在平板上涂布均匀,27 ℃下倒置培养48~72 h,计数,确定菌悬液浓度约为50~100 CFU/mL 的最佳稀释度。

将黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上,在27 ℃下培养5 d 左右,用无菌棉签、0.9%无菌氯化钠溶液(含0.05%聚山梨酯80)将孢子洗脱。吸出孢子悬液至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液将孢子悬液依次10 倍稀释至10-3~10-5稀释度,分别吸取各稀释度孢子悬液200 μL 接种至玫瑰红钠琼脂培养基平板上,每个稀释度2 个重复,将孢子悬液在平板上涂布均匀,27 ℃下培养3~5 d,计数,确定孢子悬液浓度约为50~100 CFU/mL 的稀释度。

1.4.3 取各菌液培养物按10 倍稀释法,用0.9%无菌生理盐水溶液制成含菌<100 CFU/ mL 的供试菌液。菌液制备后保存在2 ℃~8 ℃,应在24 h内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2 ℃~8 ℃,在验证过的贮存期内使用。

1.5 方法验证试验 按照《中国兽药典》2010 年版有关微生物限度检查法验证进行,验证试验至少应进行3 次独立的平行实验,验证采用薄膜过滤法进行[3]。

1.6 菌落计数及回收率测定(薄膜过滤法)[5-9]试验组 采用滤膜孔径0.45 μm、直径50 mm 的亲水混合纤维素膜酯滤膜。取1∶10 供试液10 mL(相当于含供试品1 g)加至100 mL 稀释液中,混匀,过滤,并用pH 值7.2 无菌磷酸盐缓冲液分3 次进行过滤、冲洗,每张滤膜冲洗量为100 mL×3 次,泵速160 r/min。在最后一次的冲洗液中加入50~100 CFU 试验菌,滤干后取出滤膜,菌面朝上贴于已凝固的营养琼脂平板(用于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)或玫瑰红钠琼脂平板(用于白色念珠菌、黑曲霉),每株试验菌平行制备2 张滤膜。培养条件和计数方法同常规法。

菌液组:滤膜用pH 值7.2 的无菌磷酸盐缓冲液分3 次进行过滤、冲洗,每张滤膜冲洗量为100 mL×3 次,在最后一次的冲洗液中加入50~100 CFU 试验菌,滤干后将接有细菌的滤膜取出,菌面朝上贴于已凝固的琼脂平板上,每株试验菌平行制备2 张滤膜。计数平板、培养条件及菌落计数同上。

供试品对照组:取1∶10 供试液10 mL 加至100 mL 稀释液中,混匀,过滤,并用pH 值7.2 无菌磷酸盐缓冲液分3 次进行过滤、冲洗,每张滤膜冲洗量为100 mL×3 次,滤干后取出滤膜,接触样品的粗糙面朝上贴于已凝固的琼脂平板上,每株试验菌平行制备2 张滤膜。计数平板、培养条件及菌落计数同上。

稀释剂对照组:取pH 值7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液1 mL 加至100 mL 稀释液中混匀,过滤,并用pH 值7.2 无菌磷酸盐缓冲液分3 次进行过滤、冲洗,每张滤膜冲洗量为100 mL×3 次,在最后一次的冲洗液中加入50~100 CFU 试验菌,滤干后取出滤膜,菌面朝上贴于已凝固的琼脂平板上,每株试验菌平行制备2 张滤膜。计数平板、培养条件及菌落计数同上。

阴性对照组:取试验用的稀释液1 mL(pH 值7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液),加至第一次的100 mL 冲洗液中,混匀,过滤,滤膜用pH 值7.2 的无菌磷酸盐缓冲液分3 次进行过滤、冲洗,每张滤膜冲洗量为100 mL×3 次。滤干后取出滤膜,接触样品面朝上贴于已凝固的琼脂平板上,每种培养基至少制备2 张滤膜。计数平板、培养条件及菌落计数同上。

计算方法:

稀释剂对照组的菌回收率=稀释剂对照组的平均菌落数÷菌落组的平均菌落数×100%

试验组的菌回收率=(试验组的平均菌落数-稀释剂对照组的平均菌落数)÷菌落组的平均菌落数×100%

1.7 控制菌检查方法 按照《中国兽药典》等文献[2,10-12]的相关要求,中药提取物固体口服给药制剂应对大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌进行控制菌检查。验证试验与供试品的控制菌检查同时进行,参照《中国兽药典》2010 年版等相关文献有关微生物限度控制菌的检查方法[3,13-15]。

试验组:取1∶10 供试液10 mL(相当于供试品1.0 g),加至100 mL 的pH 值7.2 无菌磷酸盐缓冲液中混匀,过滤,并用pH 值7.2 无菌磷酸盐缓冲液分3次进行过滤、冲洗,每张滤膜冲洗量为100 mL×3 次,10~100 CFU 试验菌加在最后一次冲洗液中,滤干后,将接有细菌的滤膜取出接种至相应的100 mL 增菌培养基中,依相应的控制菌检查法进行检查。

供试液组:取1∶10 供试液10 mL,过滤,冲洗,冲洗液分3 次进行过滤、冲洗,每张滤膜冲洗量为100 mL×3 次,滤干后取出滤膜接入相应的100 mL增菌培养基中,依相应的控制菌检查法进行检查。

阳性对照:滤膜用pH 值7.2 的无菌磷酸盐缓冲液分3 次进行过滤、冲洗,每张滤膜冲洗量为100 mL×3 次,在最后一次的冲洗液中加入10~100 CFU 试验菌,滤干后将接有细菌的滤膜取出,接入相应的100 mL 增菌培养基中,依相应的控制菌检查法进行检查。

阴性对照:取试验用的稀释液10 mL(pH 值7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液),加至100 mL 的pH 值7.2无菌磷酸盐缓冲液中,混匀,过滤,并用pH 值7.2无菌磷酸盐缓冲液分3 次进行过滤、冲洗,每张滤膜冲洗量为100 mL×3 次,滤干后,将接有稀释液的滤膜取出接入相应的100 mL 增菌培养基中,依相应的控制菌检查法进行检查。

1.8 供试品的微生物限度检查 依据验证试验结果,对不同批次份常山散(批号:20150725、20150812、20150822,河北正道生物科技有限公司生产)进行微生物限度的检查。细菌、真菌及酵母的总数计数,大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌及铜绿假单胞菌的检查均采用经验证的薄膜过滤法进行,具体参照2010 年版《中国兽药典》有关微生物限度控制菌的检查方法[2]。

2 结果与分析

2.1 方法验证结果 所有含供试品的锥形瓶内各试验菌均生长良好,证实供试品在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计(采用滤膜孔径0.45 μm、直径50 mm 的亲水混合纤维素膜酯滤膜。取1∶10 供试液10 mL(相当于含供试品1 g)加至100 mL 稀释液中,混匀,过滤,并用pH 值7.2 无菌磷酸盐缓冲液分3 次进行过滤、冲洗,每张滤膜冲洗量为100 mL×3 次,泵速160 r/min。在最后1 次的冲洗液中加入50~100 CFU 试验菌,可采用薄膜过滤法建立检查方法。

2.2 回收率的测定结果 见表1。结果表明,供试液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌及黑曲霉的回收率均大于70%,其次供试品和所用稀释剂对此结果无干扰。证实该试验方法和条件下,供试品常山散对细菌和真菌无抑菌活性或其抑菌作用极其微弱,薄膜过滤法可用于对该供试品进行细菌、真菌及酵母的检查。

表1 薄膜过滤法回收率测定结果 (CFU/g,n=3)

2.3 控制菌检查结果 见表2。结果表明,试验组、阳性对照组均检出相应的试验菌,而阴性对照组和阴性对照组均未检出相应的试验菌。证实薄膜过滤法可用于常山散的控制菌检查,此方法成立。

表2 控制菌检查方法验证结果(薄膜过滤法)

2.4 微生物限度检查结果 见表3。结果表明,采用经验证的薄膜过滤法对不同批次的常山散进行微生物限度检查,结果判定供试品符合口服固体制剂规定。

表3 不同批次中药常山散的微生物限度检查结果

3 讨论

药品的微生物污染控制是药品质量控制的重要指标,与化学药品相比,中药口服制剂的所用的原料药材、生产工艺具有特殊性,对制剂微生物限度检查结果的准确性有可能产生重要影响。因此作为中药口服制剂质量标准的重要组成部分,药品的微生物限度检查是微生物学质量与评价的重要依据。通过对药物制剂进行方法学验证,才可确保微生物检查方法的可靠性和检查结果的准确性[9-10,13]。微生物限度检查法可用于判断非规定灭菌制剂是否符合兽药典的规定,也可用于指导制剂的微生物质量标准制定,及指导生产过程中间产品微生物质量的监控[3]。薄膜过滤法作为药物检验技术的一种方法,因其具有操作简单、快速、数据准确的特点,而被应用于多种药品的微生物检验。除此之外,薄膜过滤法还可以作为微生物的回收和检验方法。该法在无菌检查中可以快速集菌,在药品微生物限度检查中可以去除药品中某些成分的抑菌作用,例如,应用开放式的过滤器将贴膜法与过滤法进行结合应用,可以消除药物的抗菌活性,大大提升菌落的回收率,使得回收率达到理想值,所以薄膜过滤法在药品检验中的应用越来越被重视[2]。 从常山散的方法学验证试验结果可以看出,取中药常山散10 g,用pH值7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加至100 mL,将其制备成1 ∶10 的供试液,经过薄膜过滤法方法验证试验,处理后的供试液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的加菌回收率均大于70%。表明常山散在此试验方法和条件下无抑菌作用或抑菌作用极微弱,可使加菌回收率达到满意效果,且供试品、稀释剂对此结果无干扰。另外,控制菌检查的试验组、阳性对照组均检出相应的试验菌,而阴性对照组和空白对照组均未检出相应的试验菌。 表明中药常山散的控制菌检查可采用薄膜过滤法进行,且结果可靠。

综上,供试品中药常山散的细菌、真菌和酵母计数方法和控制菌检查方法均可采用薄膜过滤法进行。本次试验供试品的细菌数、真菌和酵母数、控制菌3 项检查结果均符合该品种项下的规定,通过对3 个批号常山散进行微生物限度检查,均符合要求,表明常山散已达口服固体给药制剂的标准。其次,本次微生物限度检查方法的建立可为水溶性差的中药提取物制剂在进行同类试验时提供技术理论上的参考,而且根据验证结果选择准确可靠、可操作性高的试验方法及条件,方可更好的满足企业要求,从而共同提高药品质量。通过有效的微生物学质量控制与检验,可全面了解药品的微生物污染现状与整体生产水平,并将其作为制定该药品微生物限度检查项和限值的参考,防止微生物的污染。