猪源大肠杆菌分离鉴定及白头翁汤对其抑菌试验

杨明凡,高 航,万 博,李庆华,陈红英,张红英,夏平安

(1.河南农业大学牧医工程学院,河南 郑州450002;2.河南德邻生物制品有限公司,河南 新乡453521)

大肠杆菌可引起人和多种动物的肠道内或肠道外感染,导致肠炎和败血症等症状,是人兽共患病的主要病原。引起人和动物发病的大肠杆菌主要有三大类:肠致病性大肠杆菌(EPEC)、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)和肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)。其中引起生长猪发病的大肠杆菌主要是ETEC,临床上主要是引起幼畜腹泻和肠毒血症等。人感染该病原菌可引起腹泻和出血性肠炎,此外还可引起溶血性尿毒综合征等,严重的可导致死亡。

大肠杆菌主要是通过消化道感染为主要传播途径的病原菌。牛、羊、猪、家禽等是其主要的宿主,该菌可通过动物传染给人,也可由人传染给人,或环境中的大肠杆菌通过污染水、食物等间接的传染给人,引起人的感染发病[1-2]。因此对动物源性大肠杆菌进行分离鉴定、生物学特性研究及有效药物控制的研究就显得尤为重要,从而为有效防控大肠杆菌感染提供理论参考[3-4]。

近些年来,随着抗生素和化学抗菌药物的广泛使用,细菌的耐药菌株不断增加,并呈现出多重耐药性,导致临床上治疗细菌感染的疾病时常常得不到有效的控制,造成治疗失败,并且抗生素和化学抗菌药物有很大的毒副作用[5]。中药根据中药理论进行组方,每种中药又有多种有效成分,具有毒副作用小,无耐药性、无残留的特点,在临床治疗上显示独有的优势。本试验选用传统的白头翁汤对分离的猪源大肠杆菌进行体外抑菌和体内的治疗试验,为临床上大肠杆菌病的治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2017 年4 月-2017 年12 月,对河南省6 个不同的地区的猪场发生严重腹泻的病猪进行采样,无菌采集猪的脾脏、肾脏、肝脏、淋巴结等共48 份样品,放低温冰盒中,送实验室待处理。

1.2 主要试剂 LB 肉汤、麦康凯、伊红美蓝琼脂培养基,购自广东环凯微生物科技有限公司;微量生化鉴定管,购自杭州天和微生物试剂有限公司;标准大肠杆菌O 抗原定型血清,购自中国兽医药品监察所;PCR TaqMix 聚合酶、DL-2 000 DNA Marker,均购自宝生物工程(大连)有限公司;白头翁、黄柏、黄连、秦皮等,购自郑州市张仲景大药房。

1.3 实验动物 1 月龄小鼠,35 只,体重20 g 左右,雌雄各半,购自河南省实验动物中心。

1.4 白头翁汤的制备 白头翁汤由白头翁、黄柏、黄连、秦皮等药材(经鉴定均符合中华人民共和国兽药典(2015 年版))。按比例加入水,浸泡30 min,大火煮沸,水开后再用文火维持沸腾30 min,使药物的浓度为1 g/mL,待温时过滤去渣,取药液备用。

1.5 病原菌的分离 将无菌采集的脾脏、肾脏、肝脏、淋巴结等病料接种在LB 培养基上增菌培养,然后分别划线接种于麦康凯琼脂培养基上,挑取红色光滑湿润的菌落接种在LB 培养基上,然后再分别划线接种于伊红美蓝琼脂培养基上,挑取黑色带金属光泽的菌落做纯培养,并进行革兰染色,镜检。

1.6 分离菌生化试验 将分离的纯菌株分别接种微量生化鉴定管中进行生化试验,主要包括糖类发酵试验、吲哚试验、甲基化试验、V-P 试验、硫化氢试验、柠檬酸盐利用试验和尿素酶试验等。

1.7 动物试验 经生化试验鉴定为大肠杆菌的分离菌株分别接种于LB 培养基,37 ℃培养24 h,调整菌液浓度OD600nm值为1。取培养物0.2 mL,经口服途径给试验的小鼠接种,每株菌接种5 只小鼠为一组,同时用同量的无菌LB 液体培养基做空白对照。接种后取24~48 h 死亡的小鼠的脾脏和肝脏,按照1.5 的方法分离细菌,并进行革兰染色,镜检。

1.8 血清型鉴定 参考马增军等的O 抗原鉴定方法测定分离菌株的血清型。

1.9 毒力基因PCR 扩增 参考GenBank 公布的大肠杆菌eaeA 基因序列,设计一对引物P1-5′-GGCACAAGCATAAGCGC-3′,P2-5′-CCTGCAGCAACGAGGCA G-3′。引物由上海博尚生物技术有限公司合成。以分离株细菌DNA 为模板PCR 扩增目的基因,退火温度为54 ℃。

1.10 白头翁汤对分离菌株的体外抑菌试验 采用试管法检测白头翁汤的MIC[10]。将分离菌株接种于LB 液体培养基内,37 ℃培养24 h,调整菌液浓度OD600nm值为1。取制备好的白头翁汤药液,用LB 培养基按倍比法稀释10 个稀释度,然后每只试管分别接种20 μL 的分离菌液,同时设置不加白头翁汤的阳性对照和不加菌液的白头翁汤阴性对照,37 ℃培养24 h 后观察结果。

1.11 临床治疗 用制备好的白头翁汤给临床发病的仔猪灌服,每头猪每天1 次,每次30 mL,连用7 d,同时用氟苯尼考作为治疗对照组,氟苯尼考的用量按照使用说明书推荐量使用。

2 结果

2.1 分离菌的形态及培养特征 分离菌经革兰染色镜检,观察到革兰阴性、短小杆菌。分离细菌在麦康凯培养基上均呈粉红色、表面光滑湿润、边缘整齐的小菌落(见中插彩版图1);在伊红美蓝琼脂培养基上均呈黑色带金属光泽的菌落(见中插彩版图2)。

图1 大肠杆菌在麦康凯培养基上菌落

图2 大肠杆菌在伊红美蓝培养基上菌落

2.2 生化试验 6 株分离菌株能够分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖和L-阿拉伯糖,产酸产气;吲哚试验为阳性、甲基化试验为阳性、V-P 试验为阴性、硫化氢试验为阴性、柠檬酸盐利用试验为阴性和尿素酶试验为阴性。

2.3 动物试验 6 株分离菌株接种于小鼠后10~48 h 内全部死亡,对照组小鼠均健康存活。并从死亡的小鼠体内分离到革兰阴性短小杆菌,在麦康凯琼脂培养基上呈粉红色菌落,在伊红美蓝琼脂培养基上呈黑色带金属光泽的菌落。

2.4 血清型鉴定 玻片凝集试验显示从48 株分离株中,定型菌株6 株,分别为O8有1 株、O64有2 株、O157有3 株。

2.5 PCR 扩增 PCR 扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,在紫外灯下观察结果并拍照,结果见图1。

2.6 白头翁汤对分离菌株的体外抑菌试验 用白头翁汤对分离的6 株大肠杆菌进行MIC 测定,结果显示,白头翁汤对分离菌株MIC 均为0.625 mg/mL、MBC 均为1.25 mg/mL。

2.7 临床治疗 用白头翁汤治疗临床上的25 头发病仔猪,同时设另外20 头发病仔猪用氟苯尼考做对照,结果白头翁汤组治愈24 头,治愈率96%;氟苯尼考组治愈14 头,治愈率70%。

图3 PCR 扩增大肠杆菌eaeA 基因

3 讨论

本试验通过细菌分离、显微镜观察、生化鉴定、血清型鉴定及PCR 扩增,从6 个不同地区采集的48 份样品中分离鉴定出6 个大肠杆菌菌株,血清型鉴定结果来看O8有1 株、O64有2 株、O157有3 株,O157为主要致病性血清型在我国也多见报道。动物试验结果显示,6 株分离菌均为强毒株。PCR 扩增显示,这6 株大肠杆菌分离株均含有产生大肠杆菌粘附毒素的eaeA基因,为进一步研究大肠杆菌的致病机制奠定了基础。

大肠杆菌对抗生素的产生耐药性的现象普遍存在[6-7],王秀梅报道受试的18 种大肠杆菌分离菌株90%以上的细菌对磺胺甲噁唑、四环素和氯霉素耐药[2]。中药具有绿色、安全、无残留、不易产生耐药性等特点,发挥功效是由多种成分入药共同作用,临床上应用又多为复方,随症加减,比较经典的“白头翁汤”即如此。白头翁汤出自汉代·张仲景《伤寒论》,由白头翁、黄连、黄柏、秦皮4 味药物组成。本方具有清热解毒,凉血止痢,抗菌消炎等功效,历来被医家认为是治热毒血痢的首选药方。本试验通过体外MIC 测定表明白头翁汤对分离大肠杆菌具有较强的抑菌作用。临床治疗试验表明,白头翁汤对该病有显著的治疗效果,从而为临床上治疗猪源大肠杆菌提供了依据。