胎牛血清对人内皮细胞HMEC-1体外成血管实验影响的观察△

胡雅琼　林渺满　林　凡（福建中医药大学中西医结合学院　福州　350122）

胎牛血清对人内皮细胞HMEC-1体外成血管实验影响的观察△

胡雅琼林渺满林凡（福建中医药大学中西医结合学院福州350122）

目的：观察胎牛血清对人内皮细胞HMEC-1体外成血管实验的影响。方法：人内皮细胞HMEC-1采用相同的培养条件处理后，随机分为无胎牛血清组和胎牛血清组，分别采用无胎牛血清培养基和含胎牛血清培养基（含5%胎牛血清）接种于成血管基质胶，培养6h后用倒置相差显微镜观察不同处理组内皮细胞血管管腔形成情况。结果：无胎牛血清组的血管管腔数明显多于胎牛血清组（P＜0.05）。结论：提示在体外成血管实验中无胎牛血清的条件有利于内皮细胞毛细血管样结构的形成。

HMEC-1细胞 胎牛血清 体外成血管

血管新生是机体从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展形成新血管的过程，对于肿瘤生长、转移，以及冠心病等缺血性疾病治疗有着重要意义。随着这些疾病日益危害人类的健康，血管新生研究领域受到越来越多的关注，有关血管新生的实验方法不断发展。血管新生的过程涉及血管内皮细胞的增殖、迁移、芽生、分裂和分支以及新的毛细血管网的形成。因此，毛细血管网的形成是内皮细胞血管形成能力的最终体现。自从国外的研究者们发现血管内皮细胞在体外培养条件下具有形成毛细血管样结构的能力，内皮细胞体外成血管实验被广泛应用于血管新生研究［1～3］。但对于内皮细胞体外成血管实验条件的研究还有一些盲点。胎牛血清是细胞体外培养过程中的重要培养基添加剂，为细胞体外生长提供必需的营养物质和各种因子等。胎牛血清的添加是否影响内皮细胞的体外成血管能力？我们针对上述问题进行了研究，以期优化内皮细胞体外成血管实验方法，推动研究的开展。

1材料与方法

1.1主要材料与试剂：人微血管内皮细胞（human microvascular endothelial cells，HMEC-1）由本实验室培养并保存，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，购自美国Gibco公司），MCDB-131细胞培养基（由美国Sigma公司生产），表皮细胞生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF，购自美国Peprotech公司），氢化可的松（购自BioBasic公司），碳酸氢钠（购自上海生工生物工程有限公司），0.25%胰蛋白酶（购自美国Hyclone公司），体外成血管试剂盒（In Vitro Angiogenesis Assay Kit，购自美国Millipore公司）。

1.2细胞培养与分组处理

1.2.1细胞培养：HMEC-1细胞采用MCDB-131培养液（含10ng/ mL EGF、1μg/mL氢化可的松，10%FBS）于5%CO2，37℃常规培养。取对数生长期的细胞经0.25%胰蛋白酶消化收集，制成单细胞悬浮液后，以20×104个/孔的密度接种于6孔板。细胞经24h同步化后以含5%FBS MCDB-131培养基培养48h。

1.2.2铺设基质胶：根据In Vitro Angiogenesis Assay Kit试剂盒说明书进行操作，将基质胶稀释液与基质胶按1∶9的比例混匀后，置于冰上按50μL/孔加入预冷的96孔板中，铺平胶面后，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育1h。

1.2.3细胞分组及体外成血管：将贴壁培养的HMEC-1细胞采用0.25%胰蛋白酶消化收集后，制成单细胞悬液，随机分为胎牛血清组（5%FBS）和空白胎牛血清组（0%FBS）。然后将各组细胞悬液稀释至16×104个/mL的密度，按毎孔150μL重新接种于铺有成血管基质胶的96孔板中，于37℃、5%CO2培养箱中培养6h后，观察细胞出芽相互连接形成的管腔样结构，在200倍相差倒置显微镜下取6个视野拍照（倒置荧光显微镜系统，德国Leica公司），计数管腔形成数。

1.3统计学方法：本实验所得数据采用SPSS16.0软件独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2结果

在体外成血管实验中，内皮细胞在基质胶上生长一段时间后出芽形成管腔。形成的管腔数可反映细胞的体外成血管能力。图1显示，空白胎牛血清组的血管管腔数明显多于胎牛血清组（P＜0.05），而且管腔更大，结构更复杂，提示在体外成血管实验中无胎牛血清的条件有利于内皮细胞毛细血管样结构的形成。

3讨论

内皮细胞体外成血管实验能够有效评价某种特定因素对血管生成的影响，是体外血管新生研究的常用方法。一些实验研究表明，影响内皮细胞体外成血管的因素众多。本课题组的前期研究也发现，不同实验条件对体外成血管有较大影响。胎牛血清含有细胞生长必需的营养成分和一些生长因子，在细胞体外培养中起着至关重要的作用，亦可能是内皮细胞体外成血管实验的重要影响因子。本研究通过观察胎牛血清对人微血管内皮细胞（HMEC-1）体外成血管实验的影响，发现在胎牛血清存在或不存在的条件下，HMEC-1细胞均能在基质胶上形成血管管腔样结构。但是相对于5%浓度的胎牛血清培养基，采用无胎牛血清的培养基接种细胞至基质胶上形成的血管管腔数量更多，管腔更大，结构更复杂，提示不含胎牛血清的培养基有利于HMEC-1细胞形成血管管腔结构，这与其他研究者结论类似［4～6］。胎牛血清含有的物质大多来自母体，主要成分为多肽、蛋白质和激素。其中一些物质如促细胞增殖因子可促进细胞增殖，胰岛素有助于内皮细胞分析，氢化可的松能促进细胞增殖。因此，本研究的体外成血管过程中，胎牛血清的缺失可能抑制了人内皮细胞HMEC-1的增殖，从而有利于诱导内皮细胞分化和迁移，进而更容易形成毛细血管样结构［4］。这些结果为HMEC-1细胞体外成血管实验方法的优化提供了有效依据，有利于相关实验的顺利进行。

［1］Folkman J and Haudenschild C.Angiogenesis in vitro［J］. Nature，1980，288：551-556.

［2］Maciag T，Kadish J，Wilkins L，et al.Organizational behavior of human umbilical vein endothelial cells［J］.J.Cell.Biology，1982，94：511-520.

［3］Feder J，Marasa JC，and Olander JV.The formation of capillary-like tubes by calf aortic endothelial cells grown in vitro ［J］.J Cell Physiol，1983，116：1-6.

［4］Liu J，Wang XB，Park DS，et al.Caveolin-1 expression enhances endothelial capillary tubule formation［J］.J Biol chem. 2002 Mar 22，277（12）：10661-10668.

［5］Vailhe B，Lecomte M，Wiernsperger N，et al.The formation of tubular structures by endothelial cells is under the control of fibrinolysis and mechanical factors［J］.Angiogenesis，1998，2（4）：331-344.

［6］宋轶鹏，姜翠芳.ECV304细胞二维培养形成毛细血管样结构的观察［J］.首都医药，2006（10）：35-36.

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1672-8351（2016）08-0111-02

国家自然科学基金项目（81102844），福建省自然科学基金项目（2016J01389），福建中医药大学校管项目（X2013021），国家级大学生创新训练项目（201510393003）。