噻拉嗪对山羊不同脑区NE 及DA 含量的影响

2019-09-18李丽娜李欣然张一鸣李亚楠王宇鑫刘文瀚

中国兽医杂志 2019年5期

李丽娜,李欣然,张一鸣,李亚楠,王宇鑫,刘文瀚,陈宇,高利

(东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030)

噻拉嗪(Xylazine,商品名为隆朋)是α2-肾上腺素能受体的激动药,具有中枢性镇痛、镇静和肌松等作用[1]。不仅可以单独用于动物麻醉,而且还可以与其他麻醉剂配合应用,均能产生较好的麻醉效果,亦可增强其他麻醉剂的麻醉作用。去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)是兴奋性单胺类神经递质,同属于儿茶酚胺类,是动物体内一类非常重要的神经递质。去甲肾上腺素在中枢内分布广泛,含量较多,20 世纪60 年代初,科学家将NE 注射脑室内,发现能引起动物的血压降低、心跳减慢。有研究表明,脑内NE 参与痛觉的产生,体温的调节和觉醒的维持,并且引起心率减慢和血压降低[2-5]。多巴胺是去甲肾上腺素合成的中间产物。脑内多巴胺的作用是多方面的,在CNS 中DA 可以调节肌紧张,其递质释放是一切行为反应的基本条件[6]。脑内DA 能够参与精神活动的调节,垂体内分泌和增强疼痛敏感性[7-8]。

实验设计研究噻拉嗪对山羊各个脑区NE 和DA 含量的影响,利用山羊研究该药的麻醉中枢作用机制,以探讨噻拉嗪对山羊麻醉的中枢作用机制及其在中枢神经系统的主要作用位点。为今后噻拉嗪在临床上的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物山羊25 只,临床检查健康,体重13~15 kg,雌雄兼用,购自哈尔滨市香坊区某养殖场,试验前在动物舍喂养1 周以适应环境。试验前12 h 禁食禁水。

1.2 试验仪器和药品高效液相色谱仪(型号为Waters 600)、荧光检测器(型号为Waters 2475)、色谱柱Symmetry C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),购自Waters 公司;NE(批号为097K1450)、DA(批号为087K1174),均购自Sigma 公司;色谱级甲醇、色谱级乙腈、噻拉嗪:东北农业大学动物医学学院外科教研室提供。

1.3 样品采集与处理生理盐水对照组:肌肉注射生理盐水1.31 mL/kg·bw 后处死山羊后,剪开头皮,同时除去硬脑膜并锯开头盖骨,取出山羊脑;对于其他试验组:在每个相应时间点处死山羊,取脑。在冰上迅速将大脑,小脑,海马,丘脑和脑干分离后所有样品分别称重后液氮冷冻,并于-80 ℃保存。

取冰冻的脑组织,放入预冷的1 mL 玻璃组织匀浆器中,加入10 倍体积、4 ℃的提取液,上下转动数10 次,充分研磨组织使匀浆化(约3~5 min)。将匀浆液转入EP 管中,4 ℃高速离心15 min(4 000 r/min),收集上清液。将上清液再次转入另一EP 管中,4 ℃高速离心10 min(12 000 r/min),得上清液。取离心后所得上清液,用微孔过滤器过滤,收集过滤后的液体,得到待测样品溶液。

1.4 主要溶液的配制提取液:0.1 mol/L HClO4和0.2 mmol/L EDTA-2Na 的混合溶液。

标准液:分别精密称取标准品各5 mg,置于1 000 mL 容量瓶中,用提取液溶解并稀释至刻度,即为5 μg/mL 的溶液。再取10 mL 以上溶液用提取液稀释10 倍,配成浓度为500 ng/mL 的储备液,于4 ℃冰箱中保存待用。

流动相:甲醇与去离子水(含40 mmol/L 醋酸钠、30 mmol/L 柠檬酸、0.2 mmol/L EDTA-2Na、0.4 mmol/L 辛烷磺酸钠)按照20 ∶80 的比例(v/v)配成流动相,用1 mol/L 的NaOH 溶液准确调节pH 值=4.2。抽滤后,超声脱气30 min,置于4 ℃冰箱中备用。

1.5 色谱条件固定相Symmetry C18(4.6×150 mm,5 μm);流动相:离子水(含40 mmol/L 醋酸钠、30 mmol/L 柠檬酸、0.2 mmol/L EDTA-2Na、0.4 mmol/L 辛烷磺酸钠)和甲醇(80 ∶20 v/v);流速:0.6 mL/min;检测器:Warers 2475 荧光检测器,荧光检测波长λEX=280 nm,λEM=330 nm。进样量为20 μL,采用外标法定量分析,检测各脑区NE 和DA 的含量。

1.6 试验数据的统计与分析使用SPSS18 软件数据分析系统做单因素方差分析,P<0.05 为差异显著,P<0.01 为差异极显著。应用GraphPad Prism 5对试验数据进行作图。

2 结果

2.1 噻拉嗪对山羊不同脑区NE 含量的影响如图1 所示,山羊肌肉注射噻拉嗪后,麻醉组海马、大脑和丘脑内NE 含量均显著降低,与对照组比较分别降低了32.27%(P<0.05)、35.48%(P<0.01)和31.71%(P<0.01);恢复Ⅰ组大脑和海马中NE 仍受抑制外(P<0.05),丘脑中NE 含量显著恢复(P>0.05);恢复Ⅱ组上述各脑区内NE含量均显著恢复(P>0.05),同时与麻醉组比较差异极显著(P<0.01)。其他脑区内NE 含量均无显著变化。

2.2 噻拉嗪对山羊不同脑区DA 含量的影响如图2 所示,山羊肌肉注射噻拉嗪后,麻醉组大脑、海马和丘脑内DA 含量均显著降低,与对照组比较分别降低了33.10%(P<0.01)、35.03%(P<0.05)和27.01%(P<0.01);恢复Ⅰ组丘脑中DA 仍受抑制外(P<0.05),海马和大脑中DA 含量显著恢复(P>0.05);恢复Ⅱ组上述各脑区内DA 含量均显著恢复(P>0.05),同时与麻醉组比较差异极显著(P<0.01)。其他脑区内DA 含量均无显著变化。

3 讨论

根据我们的试验结果,噻拉嗪作为山羊麻醉作用的机制与NE 和DA 的含量变化有关。去甲肾上腺素(NE)属于儿茶酚胺类神经递质,肾上腺素能神经末梢具有合成、储存与释放神经递质NE 的功能。当α2受体激动剂使突触前膜的α2受体激动,可使NE 水平降低[9]。山羊肌肉注射噻拉嗪(12.8 mg/kg·bw)后,山羊各脑区NE 含量呈现先降低后升高的趋势,各脑组织NE 浓度的最低值均出现在麻醉组,其中大脑、海马和丘脑含量变化显著,这种先降低后升高的趋势与孙绪德等[10]报道的安氟醚麻醉对犬脑中丘脑和海马中NE 含量的影响结果相似。在大脑中NE 的含量下降最明显,下降率为35.48%,其次是海马和丘脑,下降率分别为32.27%和31.71%。大脑和海马的NE 含量在恢复I 期,丘脑的NE 含量在恢复II 期均恢复至正常水平。刘秀华等[11]使用HLPC 检测正常绵羊和注射静松灵麻醉绵羊的血液和脑脊液中去甲肾上腺素的含量,结果表明,静松灵对血液和脑脊液中去甲肾上腺素有明显的抑制作用。本试验中NE 的变化趋势与上述文献试验结果一致。分析的原因可能是噻拉嗪为一种α2肾上腺能受体激动剂,能与中枢神经系统突触前膜的α2受体结合,并激动α2受体,使突触前膜受体Na+-K+-ATR 酶活化,Ca2+外流增加,内流减少,导致细胞内Ca2+含量减少,从而抑制突触前膜去甲肾上腺素的释放[12-13]。结果表明,噻拉嗪可降低山羊大脑、丘脑和海马中NE 的含量。

图1 噻拉嗪对山羊不同脑区NE 含量的影响 (n=5,ng/mL)

图2 噻拉嗪对山羊不同脑区DA 含量的影响 (n=5,ng/mL)

多巴胺(DA)也属于儿茶酚胺类神经递质,DA是合成NE 的前体,抑制DA 的释放,会导致NE 的合成减少,而NE 受到抑制时,DA 的含量也会相应减少,两者成正相关关系[14]。山羊肌肉注射噻拉嗪(12.8 mg/kg·bw)后,山羊各脑区DA 含量呈现先降低后升高的趋势,各脑组织DA 浓度的最低值均出现在麻醉组,其中大脑、海马和丘脑含量变化显著,与对照组比较分别降低33.10%、35.03%和27.01%。哈达等[15]使用盐酸噻拉嗪对正常大鼠麻醉,并对大鼠脑中单胺类神经递质含量进行测定,发现麻醉组中的DA 含量比正常组含量低,证明盐酸噻拉嗪可使脑内DA 的含量降低。这一结果与上述文献报道的结果相似。大脑和海马DA 含量在恢复I 期,丘脑DA 含量在恢复II 期均恢复至正常水平。分析结果可能是一方面噻拉嗪抑制脑组织中NE 的释放,对DA 的合成形成负反馈调节;另一方面可能是通过激活酪氨酸羟化酶(TH)的活性,使脑组织中DA 的合成减少。结果表明,噻拉嗪可抑制大脑、海马和丘脑中DA 的含量。其中,小脑和脑干中NE 和DA 的含量变化不显著(P>0.05),无统计学变化。噻拉嗪麻醉对NE 和DA 的影响机制主要是刺激大脑前突触的α2-肾上腺能受体,阻断钙的流入,抑制肾上腺神经突触前末梢释放NE,使体内NE 的浓度降低,从而体内DA 的含量也相应下降,但是在我们的研究中小脑和脑干中NE 和DA 的含量变化不显著,可能原因是噻拉嗪对小脑和脑干内的α2-肾上腺能受体刺激小,没能阻断钙的正常流入,因此肾上腺神经突触前末梢释放NE 没有被抑制,从而使NE 和DA 的含量没有显著的变化。说明NE 和DA 可能不是噻拉嗪麻醉的作用部位,这一结果与于东序等[14]报道基本一致。