血府逐瘀汤加减方对冠心病心血瘀阻证患者血浆小分子代谢产物的影响及机制研究

郑娟娟，郭佳和，马国斌，林旭辉，张统文，郑伯仁

（厦门大学附属福州第二医院，福建 福州 350007）

冠心病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病［1］，严重危害人类健康。相对于药物长期服用后的毒副作用、介入治疗昂贵的费用和手术风险，中医药治疗显现出独特的优势，已成为冠心病治疗中的一种新选择。本课题选用血府逐瘀汤加减方治疗冠心病心血瘀阻证患者，运用气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）联用技术［2］检测其治疗前后血浆小分子代谢产物的变化，研究冠心病心血瘀阻证的相关代谢途径以及其可能的作用机制，为中医药防治冠心病提供客观、科学的理论依据。

1 资料与方法

1.1 诊断标准 西医诊断标准根据WH0制定的《缺血性心脏病的命名及诊断标准》［3］，中医辨证标准参考《中医病证诊断疗效标准》［4］辨为心血瘀阻证。

1.2 纳入标准 ① 年龄 35～80岁；② 符合西医诊断标准及中医辨证标准的稳定期患者；③ 经医院伦理委员会批准并签署知情同意书。

1.3 排除标准 ① 急性冠脉综合征；② 心肌炎；③ 非缺血性心脏病（慢性肺源性心脏病、贫血性心脏病、风湿性心脏病等）；④ 继发性高血压和不能控制的恶性高血压；⑤ 其他疾病引起的心绞痛；⑥糖尿病；⑦ 严重的肝肾功能障碍；⑧ 精神疾病；⑨恶性肿瘤等。

1.4 一般资料 选择2017年3月—2019年3月首次在我院心内科经冠状动脉造影术确诊的冠心病、并经主任中医师辨证为心血瘀阻证患者40例，采用随机数字表法分成治疗组22例和对照组18例，40例患者抽取随机数0～9，随机数除以2余数为1分入治疗组，余数为0分入对照组。2组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表 1。

表1 2组一般资料比较（）

表1 2组一般资料比较（）

组别治疗组对照组n 男22 18年龄／岁58.94±9.51 57.39±9.33病程＜6个月10 10病程＞6个月12 8 13 9女 9 9 BMI／（kg／m2）23.85±4.13 24.22±3.944 TC／（mmol／L）4.56±1.07 4.31±0.97 TG／（mmol／L）1.25±0.8 1.41±0.80 HDL-C／（mmol／L）1.17±0.44 1.06±0.36 LDL-C／（mmol／L）3.02±0.97 2.74±0.84 UA／（μmol／L）272.32±64.69 300.31±85.83

1.5 治疗方法 ① 对照组采用西医规范治疗方案［5］（双联抗血小板、调脂稳定斑块）：阿司匹林肠溶片（拜耳医药保健有限公司，规格：0.1 mg×30片，生产批号：BJ18155），每次 0.1 g，每日 1次；硫酸氢氯吡格雷片［赛诺菲（杭州）制药有限公司，规格：75 mg×7 片，生产批号：8A392］，每次 75 mg，每日1次；阿托伐他汀钙片（辉瑞制药有限公司，规格：20 mg×7 片，生产批号：75837102），每次 20 mg，每日1次。② 治疗组采用西医规范治疗方案合血府逐瘀汤加减方口服，血府逐瘀汤加减方组成：生地黄10 g，桃仁 10 g，红花 10 g，紫丹参 20 g，赤芍 10 g，川牛膝 10 g，当归 10 g，川芎 10 g，柴胡 6 g，枳壳10 g，桔梗10 g。中药由我院中药房代煎，日服1剂，每次200 mL，分2次温服。2组均治疗30 d后判定疗效。

1.6 观察指标及检测方法 2组患者治疗前后在清晨空腹状态下分别取血3 mL，保存于肝素钠抗凝管中，经离心机4 000 r／min离心10 min即刻取上清，放置在冰柜中保存，温度调节至-80℃。

运用GC-TOF-MS技术检测其治疗前后血浆小分子代谢产物的变化。GC-TOF-MS技术检测由上海百趣生物医学科技有限公司提供，气相色谱仪器由安捷伦科技公司生产，型号：7890A，质谱仪品牌由美国力可分析仪器公司生产，型号：PEGASUS HT。使用 MS-DIAL软件［6］对质谱数据进行分析，在物质定性工作中，使用了FiehnBinbase数据库，包括质谱匹配及保留时间指数匹配。所得的数据输出保存于Excel文件中。

1.7 数据分析 原始数据通过Excel编辑整理，将数据导入SIMCA 14.1软件进行多元统计分析［7］。对所得的数据采用平均中心化（mean centering）进行预处理，处理后的数据采用主成分分析法（PCA）［8］，应用正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）［9］的统计方法对结果进行分析，分析结果用散点图（score scatter plot）的形式表示。计量资料符合正态分布的以（）描述，不符合正态分布的以中位数和四分位数间距（M±QR）描述；符合正态分布的采用独立样本t检验，不符合正态分布的采用秩和检验，计数资料采用χ2检验，分别比较组间均值是否存在差异。

2 结 果

采用PCA分析法对2组治疗前后共4组的血浆小分子代谢产物数据进行分析，绘制出反映组间离散程度的散点图。

通过数据分析，建立数学模型，得到用于评价模型质量的指标：隐性变量反映自变量X的变异百分比［R2X（cum）］、隐性变量反映因变量Y的变异百分比［R2Y（cum）］和隐性变量用于预测X和 Y的百分比［Q2（cum）］。

2.1 PCA分析结果 2组治疗前后PCA分析结果见图1、图2。从散点图可见治疗组治疗前后样本分开明显，对照组治疗前后样本分开不明显。

2.2 OPLS-DA分析结果 2组治疗前后OPLS-DA分析结果见图3、图4。从散点图可见：治疗组治疗前与治疗后可以显著区分，表明治疗前后两组样本的血浆小分子代谢产物存在一定差异，R2X（cum）＝15.1%，R2Y（cum）＝70.3%，Q2（cum）＝70.3%；对照组治疗前后2组区分不显著，R2X（cum）＝34%，R2Y（cum）＝76.5%，Q2（cum）＝42.8%。

图1 治疗组治疗前后GC-TOF-MS数据的PCA分析

图2 对照组治疗前后GC-TOF-MS数据的PCA分析

图3 治疗组治疗前后GC-TOF-MS数据的OPLS-DA分析

2.3 差异性代谢产物的识别与筛选 治疗组治疗后丙酮酸、磷酸甲酯、2-羟基戊酸、木糖醇、D-半乳糖醛酸较治疗前显著下降，胆固醇较治疗前显著升高，见表2。对照组治疗前后胆固醇、丙酮酸、磷酸甲酯、2-羟基戊酸、木糖醇、D-半乳糖醛酸改变无明显差异，见表3。

图4 对照组治疗前后GC-TOF-MS数据的OPLS-DA分析

3 讨 论

祖国医学强调运用整体观探讨疾病发展的病因、病机及证治规律，调节整体平衡、把握动态变化是祖国医学的基本治疗原则，而代谢组学也强调把人体看成一个整体来研究，同时人体内的代谢产物也是动态变化的，代谢组学通过人体内代谢产物的变化，可以观察疾病发生、发展的基本规律［10］，这与祖国医学具有异曲同工之处。祖国医学强调辨病与辨证相结合，其中辨证论治是祖国医学的精髓所在，中医证型是对疾病发展过程中的某一阶段的病理概括［11］。代谢组学的研究对象是生命个体对外源性物质的刺激、环境变化或遗传修饰所做出的所有代谢应答和动态变化过程［9］，可以为中医辨证论治提供客观化的依据。代谢组学最常用的分析技术是GC-TOF-MS技术，该技术始用于上个世纪70年代，此后，在疾病的诊断研究中受到广泛运用［12］，因其具有分辨率和灵敏度高、适于痕量分析的特点，目前仍是代谢组学分析的最常用技术之一。

表2 治疗组治疗前后差异性代谢产物比较

表3 对照组治疗前后差异性代谢产物比较

本研究使用代谢组学技术评价西医规范治疗基础上合用血府逐瘀汤加减方后冠心病心血瘀阻证患者代谢产物变化，探讨血府逐瘀汤加减方的作用机制。血府逐瘀汤源于清代王清任《医林改错》，是近年来中医药方面研究较多的活血化瘀成方。血府逐瘀汤加减方是原方去甘草，加丹参而成，方中以桃仁、红花、川芎、赤芍、丹参、当归活血祛瘀；牛膝祛瘀血，通血脉，引血下行；柴胡疏肝解郁，升达清阳；桔梗开宣肺气，载药上行，合枳壳升降气机，开胸行气，使气行则血行；生地黄凉血清热，合当归又能养阴润燥，使祛瘀而不伤阴血。诸药合用，共奏活血祛瘀、行气止痛之功。代谢组学检测结果提示：在西医规范治疗基础上加用血府逐瘀汤加减方，较单纯西医规范治疗有显著性差异。

治疗组治疗后丙酮酸、磷酸甲酯、2-羟基戊酸、木糖醇、D-半乳糖醛酸较治疗前下降，这些代谢产物的异常导致了血液黏度增加，这与血瘀证稠、滞、黏、凝的特征不谋而合［13］。丙酮酸是代谢过程中重要的中间产物，三羧酸循环主要在线粒体中进行，在有足够氧气条件下，糖酵解生成的丙酮酸进入线粒体，经三羧酸循环被氧化成二氧化碳和水。酵解过程中产生的还原型辅酶I（NADH），则经呼吸链氧化产生腺嘌呤核苷三磷酸ATP和水。如果供氧不足，NADH则不会进入呼吸链，在某些生物中把丙酮酸还原成乳酸，在某些生物中丙酮酸会转变为乙醇，并释放出二氧化碳，这取决于不同的生物含有的催化酶种类不一样。此外，丙酮酸是三大营养物质之间相互转换的枢纽，可以通过氨基酸转换途径形成新的氨基酸，实现了糖类到蛋白质的相互转化。

综上所述，运用GC-TOF-MS技术可以检测冠心病心血瘀阻证治疗前后患者的血浆小分子代谢产物，同时可以通过该技术对代谢产物进行定量分析，以得到相关的差异性代谢产物；也能通过对血浆小分子代谢产物代谢通路分析，了解其主要代谢途径，这些通路可作为研究中医药作用靶点的依据。