二陈汤对肥胖大鼠脂肪组织脂质代谢关键酶LPL的影响

鄢春锦 ，廖凌虹 ，陈继承 ，丁珊珊 ，高碧珍 ，

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建省中医健康状态辨识重点实验室，福建 福州350122；3.中医证研究福建省高校重点实验室，福建 福州350122；4.泉州市中医院，福建 泉州 362000）

脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）是调节脂质代谢的关键酶，能分解脂蛋白中的三酰甘油［1-2］。有学者研究发现，小鼠的LPL基因的敲除将导致其内脏脂肪含量明显上升，体质量显著升高，脂质将沉积在靶组织［2］，因此，LPL表达的异常将影响机体的脂质代谢。二陈汤是中医四大方证之一，主要功效是燥湿化痰、理气和中，用于治疗各种痰证，近年来的研究发现其在调节脂类代谢方面作用显著［3-4］，但机制不明确。我们以肥胖大鼠为模型，观察二陈汤对大鼠LPLmRNA和LPL蛋白表达的影响，以期初步阐明其可能的分子机制。

1 材 料

1.1 实验动物 45只SPF级雄性Wistar大鼠，体质量平均为（200±20）g，3月龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：2011000521084，饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级环境。

1.2 药物与试剂 二陈汤各药物购自福建中医药大学国医堂；二甲双胍（齐鲁制药有限公司，25 mg／片，批号：3090021KC）；Trizol Reagent（美国 Invitrogen 公 司 ）；PrimerScript RT reagent Kit、SYBR Pre mix Ex TaqTM（TliRnaseH Plus）购自大连 TaKaRa公司；β-actin抗体（美国 Sigma公司）；HRP标记的羊抗兔 IgG、HRP标记的羊抗小鼠 IgG、Western blot相关试剂盒（杭州碧云天生物技术有限公司）；LPL单克隆抗体（英国Abcam公司）。

1.3 主要仪器 定量PCR仪（Epgradient型，德国Eppendorf公司）；化学发光荧光成像系统（Chemidocxrs+型，美国Bio-Rad公司）；蛋白转移仪（Miniproteam 3型，美国Bio-Rad公司）；全自动生化分析仪（7180型，日本日立公司）。

2 方 法

2.1 药物的制备 用天平称取茯苓9 g，橘红15 g，半夏15 g，甘草4.5 g置于烧杯中，加入蒸馏水浸泡30 min，文火水煎两次，混合两次水煎液后用纱布过滤，再将滤液浓缩至0.435 g／mL浓度，高压灭菌后4℃冰箱中保存备用。二甲双胍25 mg，溶于无菌蒸馏水中，配成10 mg／mL溶液。

2.2 动物分组和给药方法 大鼠适应性喂养1周后，按体质量随机分为正常组10只和造模组35只。正常组由普通饲料喂养，造模组由高脂饲料喂养，高脂饲料由l%胆固醇、20%猪油、2%奶粉、4%白糖和73%普通饲料组成。喂养10周后，取造模组内体质量超过正常组大鼠体质量均值加1.4倍标准差的大鼠，其平均体质量（444.8±31.8）g与正常组（384.0±18.0）g相比差异有统计学意义（P＜0.05），判断造模成功［5］。成功制备肥胖模型大鼠30只，其余5只大鼠体质量未达标，将其舍弃。再将30只成模大鼠按体质量随机分为二陈汤组、二甲双胍组和模型组各 10只。二陈汤组按 4.35 g／（kg·d）剂量灌服二陈汤，二甲双胍组则按 100 mg／（kg·d）灌服二甲双胍，正常组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。药物干预期间，正常组给予普通饲料，其他组给予高脂饲料，干预4周。

2.3 标本采集 末次灌胃后10 h（禁食不禁水），用20%乌拉坦腹腔注射麻醉（剂量为1 g／kg），腹主动脉采血制备血清，-80℃保存。取肾周脂肪组织200 mg，离体后马上置液氮壶内，后转至-80℃冰箱保存。

2.4 指标检测

2.4.1 血清脂质水平检测 采用日立7180自动生化分析仪检测大鼠血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。

2.4.2 实时荧光定量PCR检测脂肪组织LPLmRNA相对表达水平 各组随机选取5份脂肪组织，采用Trizol法提取总RNA，检测A260和A280比值，并计算RNA浓度，甲醛变性电泳对RNA完整性进行鉴定。逆转录合成cDNA，实时荧光定量PCR扩增目的基因，目的基因和β-actin引物由生工生物工程（上海）有限公司合成（LPL上游：5'-AACAT TGGAGAAGCCATTCG-3'，下游：5'-TTCATTCAGC AGGGAGTCAA-3'；β-actin 上游：5'-TGAGACCTTC AACACCCCAG-3'，下游：5'-GCCATCTCTTGCTCG AAGTC-3'）。PCR反应参数为：95℃预变性30 s，94℃变性 5 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 20 s，共 40个循环。采用相对定量法分析大鼠LPLmRNA相对表达水平，以 β-actin基因作为内参，利用 2-△△Ct法计算各组LPLmRNA的相对表达量。

2.4.3 Western印迹法检测脂肪组织LPL蛋白表达各组随机选取5份脂肪组织进行检测。将样品置于匀浆器中，加入700 μL单去污剂裂解液（含PMSF）进行匀浆，裂解细胞提取总蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白质。配制10%分离胶、4%的浓缩胶，经SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜，置于孵育袋中加入一抗，4℃摇动孵育过夜，洗膜后加二抗，37℃摇床孵育1 h，ECL化学发光显色，ImageJ凝胶图象软件分析光密度值。

2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件对数据进行处理。计量资料属正态分布的以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），多组间的两两比较采用t检验。

3 结 果

3.1 4组大鼠血清脂质水平比较 见表1。

表1 4组大鼠血清脂质水平比较（）mmol／L

表1 4组大鼠血清脂质水平比较（）mmol／L

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05；与二甲双胍组比较，3） P＜0.05。

组别正常组模型组二陈汤组二甲双胍组n 10 10 10 10 TC 1.40±0.11 2.00±0.091）1.82±0.133）1.50±0.232）TG 0.79±0.11 1.04±0.091）0.75±0.102）0.87±0.162）HDL-C 1.17±0.16 1.13±0.10 1.04±0.05 1.13±0.12 LDL-C 0.21±0.04 0.28±0.031）0.21±0.032）3）0.26±0.06

3.2 4组大鼠脂肪组织LPLmRNA相对表达水平比较 见表2。

表2 4组大鼠脂肪组织LPLmRNA相对表达水平比较（）

表2 4组大鼠脂肪组织LPLmRNA相对表达水平比较（）

组别正常组模型组二陈汤组二甲双胍组n 10 10 10 10 LPLmRNA相对表达量0.9994±0.1761 1.0205±0.0417 1.1503±0.1780 1.0557±0.1076

3.3 4组大鼠脂肪组织LPL蛋白表达比较 见表3、图 1。

4 讨 论

超重和肥胖是多种常见慢性疾病的重要危险因素，研究肥胖的发病机制，建立有效的预防和治疗措施是目前急需解决的问题。“肥人多痰”是中医的经典理论，廖凌虹等［6］研究也发现痰是肥胖的重要中医病理因素，从痰辨证论治，可作为治疗肥胖及其诱发的多种代谢疾病的重要手段。

表3 4组大鼠脂肪组织LPL蛋白表达比较（）

表3 4组大鼠脂肪组织LPL蛋白表达比较（）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

组别正常组模型组二陈汤组二甲双胍组n 10 10 10 10 LPL相对表达量1.2206±0.0317 1.5188±0.06031）1.7256±0.11242）1.7195±0.19112）

图1 4组大鼠脂肪组织LPL蛋白表达比较

本实验以高脂饮食诱导，制备肥胖大鼠模型。目前国内外对肥胖动物模型的鉴定缺乏统一的标准，多数学者认为正常组与造模组的体质量有显著性差异，即可判断造模组出现肥胖。本实验成模大鼠体质量超过正常组大鼠均值加1.4倍标准差，两组间差异显著，判断造模成功。通过血清生化分析，我们发现模型组大鼠TC、TG和LDL-C水平比正常组明显升高。在继续给予高脂饮食的同时，我们用二陈汤对肥胖大鼠进行药物干预4周，发现大鼠血清TG和LDL-C水平显著下降。本实验结果表明，二陈汤能在不控制饮食的情况下，降低大鼠的血脂水平，说明二陈汤可以应用于营养性肥胖伴脂代谢紊乱的治疗。而经二甲双胍干预后，则是TC和TG水平比模型组明显降低，说明两种药物的作用侧重点有所不同，但对于纠正脂质代谢异常都有积极的意义。

LPL是脂质代谢关键酶［7］，主要在脂肪组织和骨骼肌实质细胞的粗面内质网合成［8］，随后要经过复杂的细胞内加工，其活性和浓度是影响机体血脂浓度的关键因素。由于肥胖人群普遍存在脂质代谢紊乱［9］，所以我们将LPL作为切入点，观察肥胖大鼠脂肪组织LPL表达的变化。本实验结果发现，与正常组比较，肥胖大鼠LPL蛋白表达显著增高，提示肥胖大鼠血清TC、TG和LDL-C水平的上升，可能引发机体的调控机制，增强LPL蛋白的表达来对抗脂质代谢的异常。国外有学者的相关研究也提示，肥胖大鼠LPL蛋白呈高表达［10］。经过二陈汤治疗后，肥胖大鼠LPL蛋白表达比模型组进一步增强，说明二陈汤的干预促进了LPL的高表达，催化乳糜微粒和极低密度脂蛋白胆固醇中的TG水解，降低血清中TG水平，本实验中二陈汤组大鼠血清TG水平的降低也验证了这一点。二甲双胍是经典的降糖药物，是新药研发的参照基准，不仅降糖作用显著，也有很好的减轻体质量和纠正血脂异常的作用。我们实验结果提示，经过二甲双胍干预后，大鼠LPL蛋白表达明显增强。Masahiro等［11］学者在体外培养的细胞中也发现，二甲双胍能使LPL蛋白的表达显著增强，我们将二甲双胍选为阳性对照药物，具有较好的对比作用。引起我们关注的是，本研究中肥胖大鼠LPLmRNA表达与正常大鼠无显著性差异，而LPL蛋白表达出现了显著性差异，这些差异说明，药物对LPL的影响可能主要表现在翻译和翻译后水平上。

肥胖和其他慢性疾病一样，致病因素和机制非常复杂，涉及许多炎症介质、细胞因子的相互作用，关系到机体的神经体液调节。传统方药成分复杂，作用靶点众多，我们的前期实验研究证实二陈汤能促进高脂饮食诱导的代谢紊乱小鼠细胞周期依赖性蛋白激酶5调控相关蛋白1类似物1（CDKAL1）的表达，从而改善胰岛细胞功能，提高胰岛素水平［12］。本实验证实二陈汤可能通过促进LPL蛋白的表达来纠正脂质代谢紊乱，是否还影响其他因子，以及是否还有其他信号通路协同作用，有待进一步研究。