膳食补充剂丙酮酸钙的合成工艺研究

□ 林金新 福建齐衡科技有限公司

丙酮酸钙是丙酮酸的钙盐，其性质稳定，主要作用有减肥清脂、增加耐力、钙营养补充剂、降低胆固醇和低密度胆固醇、改善心脏功能等[1]。至今为止未发现任何副作用，也可以通过兴奋剂测试，所以丙酮酸钙刚在美国上市就被评为A类膳食补充剂。其生产方法有天然提取、化学合成，天然提取由于从苹果中提取收率低、成本高不具有工业生产意义，目前主要使用化学合成制备丙酮酸钙，以丙酮酸为底物，钙的来源为碳酸钙分解为氧化钙，再加水生产氢氧化钙，与丙酮酸反应生产丙酮酸钙[2]。而丙酮酸的来源主要有酒石酸合成法和发酵法，酒石酸合成丙酮酸钠的工艺简单但污染严重，同时成本过高，达8元/t[3]；发酵法生产丙酮酸，使用光滑球拟酵母发酵70 h左右，丙酮酸含量70 g/L，糖酸转化率70%，发酵成本低但周期长，且发酵液中杂质过多，不适合直接使用丙酮酸溶液进行丙酮酸钙的合成[4]。开发酶法生产丙酮酸钙的工艺对其生产来说具有一定的现实意义，具有一定的工艺创新。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

表达乳酸氧化酶的大肠杆菌基因工程菌E.coli-pET28a-MLOD，本实验室构建保存。

1.1.2 培养基

种子培养基（LB）：胰蛋白胨（OXOID）10 g/L、酵母提取物（OXOID）5 g/L、NaCl 10 g/L，121 ℃ 灭 菌22 min。

摇瓶发酵培养基（TB）：甘油5 g/L、细菌学蛋白胨（环凯）24 g/L、酵母提取物（环凯）12 g/L、KH2PO42.31 g/L、 K2HPO4·3H2O 16.43 g/L，121 ℃灭菌 22 min。

1.1.3 药品、试剂

L-乳酸（河南金丹）、过氧化氢酶（夏盛）、氢氧化钙（国药）。

1.1.4 仪器

梅特勒pH计、电动搅拌器、真空循环水泵恒温水浴锅、摇床、灭菌锅、鼓风干燥箱和恒温培养箱。

1.2 方法

1.2.1 摇瓶发酵工艺

以上两起谣言稍有点科学常识的人都能辨别，但前几年热炒的“碘盐致癌”论，则显得有科学性了。随着人们生活习惯和环境的改变，国家标准也会进行适当的调整，如2011年国家标准将食盐中碘含量从20-50mg/kg（mg/kg）调整为20～30 mg/kg，这本是正常的事情，却有人质疑道，是不是我们过去吃碘太多了？而碘摄入过多，会引起甲状腺癌，于是得出结论：我国居民过去吃碘太多，引起了甲状腺癌高发。其实，只要看一看国家食品安全风险评估中心的《中国食盐加碘和居民碘营养状况的风险评估》报告，就知道过去的碘摄入并未引起甲状腺癌高发。

甘油管中划LB平板，37 ℃恒温培养16 h；从平板中挑取单菌落至LB试管，37 ℃，220 r/min恒温摇床培养16 h；从LB试管按接种量2%接种至TB摇瓶（装液量20%），37 ℃培养4～5 h，然后加入诱导剂IPTG至终浓度0.2 mmol/L，降温至30 ℃继续培养20 h结束发酵。

1.2.2 酶催化工艺

发酵菌体离心收集后，-20 ℃冷冻16 h待用。使用5 L摇瓶，装液量1 L，加入浓度100 g/L的L-乳酸，调节pH和温度至预定值，加入冷冻菌体和过氧化氢酶，固定转速250 r/min，生物酶膜反应器SBA-40E检测乳酸含量，直至无底物残留停止反应，温度、pH和过氧化氢酶的添加量做单因素试验确定。

（1）温度。湿菌投量4%，初始pH8.0，过氧化酶添加量2%，温度控制10、15、20、25、30、35 ℃和40 ℃，反应1 h检测丙酮酸含量。

（2）pH。湿菌投量4%，温度20 ℃，过氧化酶添加量2%，pH控制6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，反应1h检测丙酮酸含量。

（3）过氧化酶添加量。湿菌投量4%，温度20 ℃，pH 8.0，过氧化酶添加量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%，反应1 h检测丙酮酸含量。

1.2.3 丙酮酸钙合成工艺

配制500 mL 20%的氢氧化钙乳液，保温50℃，保持搅拌。缓慢滴加丙酮酸转化液，直至pH 7.0～7.5。pH稳定后，逐渐降温至20 ℃以下，抽滤收集晶体，烘干称重，HPLC测定丙酮酸钙的含量。

1.3 丙酮酸和丙酮酸钙含量测定[5]

2 结果与分析

2.1 酶催化工艺条件试验

2.1.1 最适温度

如图1所示，乳酸氧化酶酶活随温度的升高呈抛物线变化，先上升再下降。在低温区域，温度升高有利于底物与酶的有效结合，促进酶促反应；在高温区域，温度升高不利于酶的稳定性，所以乳酸氧化酶的最适温度应在20 ℃。

2.1.2 最适pH

如图2所示，随pH增加，乳酸氧化酶的酶活也呈现先上升后下降的趋势，于pH 8.0丙酮酸含量最高，最适pH应为8.0。

2.1.3 过氧化氢酶（CAT）添加量

图1 不同温度条件对乳酸氧化酶酶活的影响

图2 不同pH对乳酸氧化酶酶活的影响

图3 不同CAT添加量对酶活的影响

如图3所示，随着过氧化氢酶的添加量增加，丙酮酸含量先升高再降低。这是因为乳酸生产丙酮酸的过程中，会有副产物过氧化氢生产，过氧化氢会分解丙酮酸。所以增加CAT的含量有助于丙酮酸的积累，但如果CAT含量过高，CAT酶液中的杂质会一定程度上抑制酶活，最终选取2%为CAT的添加量。

2.1.4 小结

发酵菌体离心收集后，-20 ℃冷冻16 h待用。使用5 L摇瓶，装液量1 L，加入浓度100 g/L的L-乳酸，调节pH 8.0，20 ℃，加入40 g冷冻菌体和20 mL过氧化氢酶，固定转速250 r/min，生物酶膜反应器SBA-40E检测乳酸含量，直至无底物残留或底物不减少停止反应。反应24 h后经HPLC检测丙酮酸含量为89.6 g/L，乳酸未检出。

2.2 丙酮酸钙合成工艺

配制500 mL 20%的氢氧化钙乳液，保温50 ℃，保持搅拌。缓慢滴加2.1中所得丙酮酸转化液，直至pH 7.0～7.5。pH稳定后，逐渐降温至20 ℃以下，抽滤收集晶体，烘干称重，HPLC测定丙酮酸钙的含量。

上述反应共滴加丙酮酸转化液1 060 mL，含丙酮酸约95 g，与氢氧化钙的摩尔比约为0.8∶1，抽滤后烘干称重为100.9 g，丙酮酸钙含量经HPLC检测为91.7%，核算纯丙酮酸钙的收率为80.1%。

3 结论与展望

以乳酸为底物通过乳酸氧化酶合成丙酮酸，然后用丙酮酸转化液代替市售丙酮酸钠作为底物合成丙酮酸钙，经实验证明，该路线具有可行性，并在丙酮酸钙的工业生产上具有较大的应用价值，可以减少污染并增加丙酮酸钙的产品附加值。