云南盐津乌骨鸡与武定鸡肌肉蛋白质组学差异研究

肖智超,王桂瑛,王雪峰,谷大海,普岳红,徐志强,范江平,葛长荣,廖国周,*

(1.云南农业大学，云南省畜产品加工工程技术研究中心,云南昆明 650201;2.云南农业大学，食品科学技术学院,云南昆明 650201)

云南省地方家鸡资源丰富,盐津乌骨鸡及武定鸡都是云南优良地方家鸡品种的代表。盐津乌骨鸡产于云南省盐津县,因生长分布于乌蒙地区得名“乌蒙珍禽”,它集味美、保健、药用于一体,体型外貌和生成性能相对稳定,属于药用肉蛋兼用型品种[1]。武定鸡主产于武定、禄劝两县,属肉蛋兼用型品种,具有体型大、产肉多、肉嫩脂丰、皮脆骨酥、味鲜质优、适应性强、耐粗饲、善于觅食等特点[2]。

肉质性状主要受基因和蛋白质调控,运用蛋白组学技术,通过对不同动物以及部位的肌肉蛋白质进行研究分析,可进一步探寻肉品质与肌肉蛋白质之间的联系。近年研究表明,蛋白质组与肉的嫩度有很多相关性。肌肉嫩度主要是由肌纤维相关组成蛋白、可溶性的肌肉组织和肌节调控共同影响的[3]。此外,肌间脂肪含量也会间接影响肉的嫩度[4]。目前,研究者已对盐津乌骨鸡和武定鸡理化特性[5-8]、遗传多样性[9-10]等方面进行分析,而对其肌肉蛋白组鲜有报道,因此比较这两种地方家鸡品种不同部位蛋白质差异,对人们了解家禽生长期间肌肉蛋白质变化,探讨肌肉生长于肉品品质的相关性具有重要意义。双向凝胶电泳(Two dimensional electrophoresis,2DE)是目前蛋白质组学最常用的方法之一[11],将双向电泳和质谱鉴定相结合的蛋白质组学技术可有效分析肌肉中数以千计的蛋白质表达量。目前,与家禽肉质相关的蛋白质组学研究还较少,廖国周等[12]对腾冲雪鸡的胸肌、腿肌的蛋白质差异点进行分析,发现110个点存在差异表达。Doherty等[13]发现蛋鸡在不同生长时期,其鸡胸肉中与生长相关的几种蛋白质在表达水平上差异显著。

本文以盐津乌骨鸡及武定鸡为研究对象,分析其腿肌与胸肌中蛋白表达差异,并对分离的差异蛋白点利用基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF MS)进行鉴定,对比研究盐津乌骨鸡和武定鸡特有蛋白质,为进一步研究地方家鸡特征性蛋白提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

140日龄盐津乌骨鸡、武定鸡母鸡各6只(屠宰后分别选取腿肌和胸肌作为样品,同一部位做三次重复并置于-80 ℃储存) 云南农业大学实验种鸡场;胎牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)标准品、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、碳酸氢铵 美国Sigma公司;三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸 美国Amresco公司;N,N,N,N-四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine,TEMED)、过硫酸铵(ammoniumpersulfate,AP)、碘乙酰胺 美国Amersham公司;胰酶与十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate,SDS) 美国Promega公司;固相pH梯度缓冲液(pH4.0～7.0) 美国GE公司;固相pH梯度干胶条(24 cm,pH4.0～7.0) 美国Bio-Rad公司;其它试剂均为分析 纯国药集团。

EttanIPGphor III等电聚焦电泳仪 美国GE Healthcare公司;EttanDALTsix二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳仪 美国GE Healthcare公司;Powerlook1100凝胶扫描仪 美国Umax公司;Autoflex speedTMMALDI-TOF/TOF质谱仪 德国Bruker Dalton公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质的提取及纯化 取1 g肌肉样本于研钵中加入液氮研磨成粉后加入10倍体积-20 ℃预冷的10% TCA/丙酮溶液,置于-20 ℃沉降过夜,在4 ℃、12000 r/min条件下离心20 min,弃上清液,沉淀物加预冷丙酮洗涤后,再于4 ℃、12000 r/min条件下离心15 min,重复操作2次,沉淀经真空干燥后,置于-20 ℃备用。

1.2.2 蛋白质定量 采用Bradford法[5]进行蛋白质定量,-80 ℃保存备用。

1.2.3 双向电泳

1.2.3.1 等电聚焦 等电聚焦电泳参照IPGphor Ⅲ等电聚焦系统使用指南进行。肌肉蛋白与水化液(含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、1% DTT、0.7% IPG(两性电解质)缓冲液、0.002%溴酚蓝)充分混合后取460 μL上样。非线性IPG干胶条放入水化液,覆盖一层矿物油防止等电聚焦时尿素析出、蛋白氧化及产生冷凝水,置于EttanIPGphor等电聚焦仪中,重泡胀和等电聚焦均在20 ℃进行,每根胶条限流50 μA。

1.2.3.2 胶条平衡 等电聚焦完毕后,胶条先在8 mL平衡缓冲液Ⅰ(pH8.8的0.05 mol/L Tris-HCl、6 mol/L尿素、30%甘油、2% SDS、0.002%溴酚蓝、0.1 mol/L DTT)中平衡15 min,再在8 mL平衡缓冲液Ⅱ(除0.25 mol/L碘乙酰胺替换0.1 mol/L DTT外,其余组分同平衡缓冲液Ⅰ)中平衡15 min。

1.2.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 将平衡后的IPG胶条转移至浓度12.5%的凝胶上端,用0.8%低熔点琼脂糖封顶,待琼脂糖凝固后即可进行第二向SDS凝胶电泳。电泳参数设置:2 W/gel,运行45 min,然后17 W/gel,直至溴酚蓝指示线跑至胶底缘时电泳结束,约4.5 h。IPG胶条的最大电流为50 μA/gel,凝胶厚度为1 mm。

1.2.4 染色与图像分析 电泳结束后剥离凝胶,置于考马斯亮蓝溶液中固定染色2～4 h,换脱色液脱色,直到背景无色透明,蛋白点清晰为止。脱色后的双向电泳凝胶经扫描仪扫描保存图像,图像分析采用imageMaster 2D platinum 5.0软件进行。

1.2.5 质谱样品制备 使用MALDI-TOF/TOF质谱仪对差异蛋白点进行质谱检测,激光波长为355 nm,重复速率为200 Hz,加速电压为20 kV,最优质量分辨率为1500 u。

1.3 数据处理

使用imageMaster 2D platinum 5.0软件对凝胶图像进行分析。当两组样品间蛋白的相对丰度比>1.5且p<0.05则判断为差异蛋白点。

蛋白质质谱数据分析先采用软件flexAnalysis过滤基线峰、识别信号峰,以BioTools软件搜索NCBI数据库,寻找匹配的相关蛋白质并鉴定蛋白质种类。

2 结果与分析

2.1 盐津乌骨鸡、武定鸡肌肉蛋白质组的双向电泳图谱

由图1～图4可见,电泳分离较充分,武定鸡腿肌肉共发现(1585±19)个蛋白质点,胸肌肉共发现(1516±28)个蛋白质点;盐津乌骨鸡腿肌肉共发现(1421±34)个蛋白质点,胸肌肉共发现(1329±25)个蛋白质点。通过imageMaster 2D platinum软件分析凝胶上的蛋白质点发现,盐津乌骨鸡腿肌、胸肌与武定鸡腿肌、胸肌的双向电泳表达谱基本相似,但是有部分蛋白点的表达有差异,两两进行比较分析发现,盐津乌骨鸡腿肌比其胸肌表达量高的有55个蛋白点,胸肌比腿肌表达量高的有54个蛋白点;盐津乌骨鸡腿肌与武定鸡腿肌相比较,盐津乌骨鸡比武定鸡表达量高的有28个蛋白点,武定鸡比盐津乌骨鸡表达量高的有59个蛋白点;盐津乌骨鸡胸肌与武定鸡胸肌相比较,盐津乌骨鸡比武定鸡表达量高的有44个蛋白点,武定鸡比盐津乌骨鸡表达量高的有47个蛋白点;武定鸡腿肌比其胸肌表达量高的有69个蛋白点,胸肌比腿肌表达量高的有49个蛋白点。在盐津乌骨鸡腿肌、胸肌蛋白电泳图谱上选取11个差异倍数大于2倍且达到显著水平(p<0.05)的蛋白点,如图1、图2所示;在武定鸡腿肌、胸肌蛋白电泳图谱上选取13个差异倍数大于2倍且达到显著水平(p<0.05)的蛋白点,如图3、图4所示。

图1 盐津乌骨鸡腿肌双向电泳图谱

图2 盐津乌骨鸡胸肌双向电泳图谱

图3 武定鸡腿肌双向电泳图谱

图4 武定鸡胸肌双向电泳图谱

2.2 差异表达蛋白质的鉴定和数据库检索

选取的差异蛋白斑点经过酶解之后,以MALDI-TOF/TOFMS分析得到肽段质量指纹图谱,获得的m/z数据送入NCBI非冗余数据库,通过Mascot搜索引擎检索,检索分值在67分以上视为可信结果(p<0.05)。根据检索结果,鉴定的盐津乌骨鸡、武定鸡腿肌和胸肌中差异表达蛋白的相关数据见表1。由表1可见,盐津乌骨鸡腿肌和胸肌中分别鉴定出8种和7种蛋白;武定鸡腿肌和胸肌中分别鉴定出9种和7种蛋白,鉴定为核纤层蛋白A、磷酸葡萄糖变位酶1、β-烯醇酶、原肌球蛋白1、三磷酸腺苷合成酶、C-反应蛋白前体、B链α-晶状体蛋白、肌酸激酶M型、乙二醛酶1、磷酸甘油酸激酶 PGK1、慢骨肌肌钙蛋白T、蛋白酶体非ATP酶调节亚单位14、热休克蛋白β-1超氧化物歧化酶、以及一些假设蛋白和非特征性蛋白。

表1 盐津乌骨鸡腿肌与胸肌中差异表达蛋白的质谱鉴定结果

核纤层蛋白A是细胞核内骨架蛋白,是构成核纤层的主要成分,核纤层蛋白A和它的结合蛋白可以维持细胞核结构和机械力量,以及参与一些细胞核内活动。如果核纤层蛋白A确实严重则会影响生物的正常生长发育,引起肌组织的营养不良和核膜结构的紊乱[14]。磷酸葡萄糖变位酶1(PGM1)是糖原代谢的重要调节酶之一[15],许多蛋白都含有PGM1,其对蛋白的磷酸化作用可影响牛肉的嫩度[16]。烯醇酶是糖酵解途径中的一种重要酶类,其单体主要有α、β和γ型,β-烯醇酶主要存在于心肌和骨骼肌中,也被称为肌肉特异性烯醇酶[17-18]。以上三种蛋白在盐津乌骨鸡腿肌中含量较高,因此盐津乌骨鸡腿部肌肉拥有更强的运动能力。

原肌球蛋白(Tropomyosin,TM),广泛分布在骨骼肌、心肌和平滑肌以及多种非肌肉细胞中,其对肌肉收缩起到重要作用[19],脊椎动物中存在4种TM,分别为TPM1、TPM2、TPM3 和 TPM4[20]。其中原肌球蛋白1(TPM1)其在小鼠、鸡和鸭胸肌中具有较高表达量[21-22]。辅酶Q(CoQ)作为线粒体呼吸链电子传递和质子转移的一个流动性载体,对细胞线粒体的生理功能具有重要的调节作用[23]。

C-反应蛋白(CRP)是由肝脏合成的一种典型急性时相蛋白,当机体患有炎症或组织损伤等状况时,血浆中含量极具增加[24]。可推断盐津乌骨鸡鸡胸肉中CRP含量较高可能是由于胸部肌肉患有炎症引起的。B链α-晶状体蛋白(CRYAB)属于热应激家族蛋白,CRYAB可以阻止细胞凋亡,进而减缓肉成熟速度,增大肌肉剪切力,其表达量与剪切力呈正相关[25-26]。超氧化物歧化酶是清除自由基的主要酶之一,它可以催化清除体内的超氧阴离子自由基,从而阻断自由基的连锁反应,保护机体免受其害[27]。有研究证明,SOD活性越高、MDA含量越低的肌肉,其系水力越高、肉色越鲜艳,并且肉质越细嫩[28]。乙二醛酶1是一种以谷胱甘肽作为辅酶,将甲基乙二醛转化为乳酸的酶。原肌球蛋白1的主要作用是加强和稳定肌动蛋白丝,抑制肌动蛋白与肌球蛋白结合。肌酸激CKM(creatine kinase,muscle)是一种肌肉特异型同功酶,是肌肉发育和分化的标志也是骨骼肌能量代谢的关键酶[29]。磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinasePGK)是生物体糖酵解的关键酶,如机体缺乏磷酸甘油酸激酶则会引起生物体代谢等功能的紊乱[30]。骨骼肌根据收缩能力可分为快肌和慢肌两种类型[31],肌钙蛋白是调节肌肉收缩的关键蛋白,包括肌钙蛋白T、I和C[32]。热休克蛋白β-1(HspB1)具有维持细胞结构稳定,参与调节细胞生长和分化、抑制细胞凋亡和增强细胞应激耐受等作用[33]。此外,本试验中还鉴定出一些未分类的假设蛋白和非特征性蛋白,这些蛋白质的功能以及蛋白质之间的相互作用,还有待做更进一步的研究。

3 结论

本试验利用DE技术分离了云南盐津乌骨鸡和武定鸡腿肌与胸肌中蛋白质,并以MALDI-TOF/TOF MS鉴定出其中的差异蛋白质点,得出以下结论:

利用蛋白质双向电泳技术,发现在盐津乌骨鸡与武定鸡肌肉中存在178个明显表达差异的蛋白点,其中在盐津乌骨鸡中蛋白明显上调的有72个,在武定鸡中蛋白明显上调的有106个。

据差异蛋白分析结果,筛选出具有统计学意义和规律性变化差异蛋白点进行质谱鉴定,经过Mascot搜索引擎检索后成功鉴定出31个蛋白质点。为核纤层蛋白A、磷酸葡萄糖变位酶1、β-烯醇酶、原肌球蛋白1、三磷酸腺苷合成酶、C-反应蛋白前体、B链α-晶状体蛋白、肌酸激酶M型、乙二醛酶1、磷酸甘油酸激酶 PGK1、慢骨肌肌钙蛋白T、蛋白酶体非ATP酶调节亚单位14、热休克蛋白β-1超氧化物歧化酶、以及一些假设蛋白和非特征性蛋白。