微生物来源的β葡萄糖苷酶在食品工业中应用进展

张媛媛,苏 敏,朴春红,*,胡 洋,刘俊梅,薛艳杰,于寒松

(1.吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118;2.敦化市农业技术推广中心,吉林敦化133700)

β-葡萄糖苷酶,又称β-葡萄糖苷水解酶(β-glucosidase,EC 3.2.1.21),它可水解末端、非还原性的烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的β-D-糖苷键,同时释放葡萄糖和相应的配基。作为纤维素酶系的重要组成部分[1],β-葡萄糖苷酶主要作用于β-1,4-葡萄糖苷键,也能作用于β-(1,1)、(1,2)、(1,3)、(1,6)糖苷键,能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖和β-D-木糖苷[2],该酶存在于几乎所有的生物体内,是生物体糖代谢途径中不可或缺的一类酶。不同来源的β-葡萄糖苷酶的相对分子量、结构和组成差异很大。已有研究报道,不同微生物所产的β-葡萄糖苷酶的相对分子量从几十到几百kDa[1],在碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate-active enzymes database,CAZy)中,基于氨基酸序列的同源性和结构的相似性,将已知的β-葡萄糖苷酶分为7个家族:GH1、GH2、GH3、GH5、GH9、GH30和GH116[3-5],不同来源的β-葡萄糖苷酶所属的家族也不同,细菌、植物来源的β-葡萄糖苷酶属于GH1家族,许多真菌来源的β-葡萄糖苷酶属于GH3家族。

随着国内外研究学者对β-葡萄糖苷酶的深入研究发现,微生物发酵产生的β-葡萄糖苷酶具有活性高、底物特异性强等特点,如青霉[6]、黑曲霉[7-9]等。同时,微生物发酵获得的β-葡萄糖苷酶容易获得高纯度的酶制剂。因此近几年微生物发酵生产β-葡萄糖苷酶的研究和应用越来越受到广泛的关注。本文主要阐述生产β-葡萄糖苷酶微生物的主要来源和特性及其在食品加工中的应用进展,分析和指出目前存在问题和解决途径。

1 β-葡萄糖苷酶的生产菌株

微生物来源的β-葡萄糖苷酶其数量庞大,价格低廉,制备容易而且用途广泛。迄今为止,大规模生产的β-葡萄糖苷酶多数来源于自然界的微生物,主要集中在霉菌、酵母菌和细菌等。霉菌来源的β-葡萄糖苷酶研究较早,也比较充分。近几年陆续有关于酵母菌如马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、细菌如植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)产β-葡萄糖苷酶的相关研究。

1.1 霉菌来源

霉菌一直是产β-葡萄糖苷酶的一个重要来源,在工业中广泛应用。包括黑曲霉、米曲霉、绿色木霉、青霉菌等。表1列举了部分霉菌来源的β-葡萄糖苷酶酶学特性。从表1可以发现,大部分霉菌β-葡萄糖苷酶的最适温度在40～60 ℃之间,最适pH大部分为酸性,一般在4.5～6.0之间,也有部分菌株所产的β-葡萄糖苷酶偏碱性。如毛霉菌(MucormieheiYH-10)[10]和米曲霉(Aspergillusoryzae)[11]分泌的β-葡萄糖苷酶的最适pH都达到8.0。近年来,耐热的β-葡萄糖苷酶越来越受欢迎。彭利沙等[12]从绿色木霉(TrichodermavirideGIM3.139)中分离的β-葡萄糖苷酶最适温度为80 ℃,随着反应时间延长,在70～80 ℃条件下酶活可维持在90%,在80～95 ℃反应一段时间后,酶活虽有下降趋势,但相对酶活仍维持在50%,具有较好的耐热性;一些霉菌分离出的β-葡萄糖苷酶在宽范围的温度和pH下都有较好的稳定性。Abdella等[13]研究发现从耐高温黑曲霉(AspergillusnigerNRRL3122)所分离出的β-葡萄糖苷酶最适pH为3.98,低于其他霉菌来源的β-葡萄糖苷酶,在pH为3时,其相对酶活仍能保持在70%以上。白葡萄酒酿造中,常常添加外源糖苷酶促进香气浓郁的萜烯化合物的释放[14],但是葡萄醪pH一般为3.0～3.5,因此耐酸性β-葡萄糖苷酶对葡萄醪中糖苷态的香气前体物质的转化具有重要的作用。Zhou等[15]从一种来源黑曲霉(AspergillusnigerSK34.002)的β-葡萄糖苷酶在55 ℃下孵育12 h后仍保持74%的酶活性,而且在4 ℃下储存7个月后,它的酶活性几乎保持不变,其显著的热稳定性和储存稳定性在水解工业生产中非常有利。

表1 部分霉菌来源的β-葡萄糖苷酶的性质

不同来源的β-葡萄糖苷酶水解底物的类型也不同,如对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)、水杨苷、纤维二糖等。Xie等[7]从黑曲霉(AspergillusnigerNo.5.1)分离出的β-葡萄糖苷酶水解p-NPG和纤维二糖比水解对硝基苯-β-D-吡喃木糖苷、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖和七叶苷更有效,但不能水解结晶纤维素。常军等[9]从黑曲霉(Aspergillusniger)分离的β-葡萄苷酶对纤维二糖的亲和性最大,对麦芽糖、昆布糖几乎没有水解作用,说明该酶可水解β-1,4-糖苷键,但基本上不水解α-1,4-糖苷键和β-1,3-糖苷键。Guo等[16]从根毛霉(RhizomucormieheiCAU432)分离的β-葡萄糖苷酶在芳基糖苷中对p-NPG水解性最高,在低聚糖中对昆布二糖水解性更高,可催化各种寡糖中β-1,2、β-1,3、β-1,4和β-1,6键的裂解,尤其是β-1,3-糖苷键并具有较高的转糖基活性,在一定条件下可将葡萄糖和纤维二糖合成龙胆二糖。Gao等[17]从青霉菌(Pencilliumpiceum)分离的β-葡萄糖苷酶对水杨苷的水解性更高,并且也能水解木糖,是一种具有β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶活性的新型双功能糖苷水解酶。每种酶的独特性质为食品药品行业特定需求提供更多的选择性。

1.2 酵母菌和乳酸菌来源

发酵在食品工业中占有非常重要的地位,特别是酵母菌和乳酸菌发酵。很多食品原料中,大部分芳香物质以糖苷前体形式存在,发酵过程中产生的β-葡萄糖苷酶可以将它们释放为游离的芳香物质,提高产品的感官特性和质量。另一方面,部分霉菌会产生对人身体有害的毒素[21],不能直接加入到食品中。因此,扩大β-葡萄糖苷酶的生产种类也显得越发重要。表2列举了部分酵母菌和乳酸菌来源的β-葡萄糖苷酶酶学特性。

表2 部分酵母菌和乳酸菌来源的β-葡萄糖苷酶的性质

酿酒酵母一直以来是葡萄酒发酵的主要微生物,但是越来越多的研究表明,非酿酒酵母如长饱洛德酵母(Lodderomyceselongisporus)、发酵毕赤酵母(Pichiafermentans)在葡萄汁酒精发酵中发挥重要作用,发酵过程中贡献更多的芳香类化合物[22-23],使葡萄酒具有更加复杂的口感和香气,与其产生的β-葡萄糖苷酶有关。已有研究证明马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)是耐热β-葡萄糖苷酶的有效生产者[24]。K.marxianus菌株常见于各种奶制品,如kefir粒、软奶酪、奶酪等,已经被分离和鉴定[25-26]。K.marxianus显示了一些独特的性质,由于其在各种底物和环境中的耐高温能力[27]、生长速率快和富含丰富的酶系统的特点,如脂肪酶[28]、蛋白酶[29]、葡聚糖酶[30]、β-葡萄糖苷酶[31]等,是工业过程中理想的微生物原料。不同的来源的K.marxianus,如酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母[27]是食品安全级的,并且在欧洲已经被列入食品安全生物制剂的权威名单中,可以添加到食品和饲料中[32]。目前,研究表明K.marxianus可以作为益生菌,其效果在临床研究已经得到认可[33-35],并且发现该菌株具有高β-葡萄糖苷酶的活性[36]。除此之外,食品安全级的乳酸菌也可以分泌出独特的β-葡萄糖苷酶。Ko等[37]从朝鲜泡菜乳酸菌(LactobacilluskimchiJB301)发酵液中分离出的β-葡萄糖苷酶,可以将虎杖中提取的白藜芦醇苷转化为白藜芦醇,产率高达99%,与其他来源的β-葡萄糖苷酶的生产成本高和发酵过程中可能产生的毒性[38-39]弊端相比,LactobacilluskimchiJB301来源的β-葡萄糖苷酶具有高食品安全性特点,在功能性食品中有较高潜在应用价值。

1.3 其它微生物来源

除了上述来源的β-葡萄糖苷酶外,还有一些其他来源的β-葡萄糖苷酶具有其独特的性质,表3列举了其他微生物来源的β-葡萄糖苷酶酶学特性。

表3 其他来源的β-葡萄糖苷酶的性质

Hernandez-Guzman等[48]从申克孢子丝菌(SporothrixschenckiiEH-206)发酵液分离的β-葡萄糖苷酶,为由两个相同亚基构成的二聚体,每个亚基的分子量96.8 kDa,其分子量在197 kDa左右,主要水解纤维二糖、昆布糖、4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷和对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。Asic等[49]所研究的双孢蘑菇菌(Agaricusbisporus)分泌的β-葡萄糖苷酶催化反应迅速,最大反应速率为833 U/mg,是由两个分子量大约为46和62 kDa亚基构成的二聚体。变形杆菌(ProteusmirabilisVIT117)[50]分离的β-葡萄糖苷酶表现出极强的耐碱能力,其最适pH为9.0,而从嗜热微生物中分离出来的β-葡萄糖苷酶显示出极强的耐热能力,如Mallek-Fakhfakh等[51]发现的嗜热真菌(TalaromycesthermopHilus)分泌的β-葡萄糖苷酶在50 ℃下可以稳定34 h,Kong等[52]从嗜热细菌(ThermotoganapHthopHilaRUK-10)发酵液分离出的重组β-葡萄糖苷酶最适温度为95 ℃,在75、80、85和90 ℃下的半衰期是分别为84、32、14和3 h。

2 β-葡萄糖苷酶在食品中的应用

β-葡萄糖苷酶可以广泛的应用于食品工业、保健品、生物能源、农业、医药等领域[56],特别是食品工业和保健品领域。果汁、果酒和茶叶中存在多种风味物质且极易挥发,但自身又存在没有香味且不易挥发的风味前体物质,在β-葡萄糖苷酶作用下裂解糖苷键,产生具有浓郁香气的芳香物质。因此,在食品工业中β-葡萄糖苷酶可以起到增香的作用。在保健品行业中,β-葡萄糖苷酶可将异黄酮糖苷转化为较高活性的异黄酮苷元,也可以使白藜芦醇苷水解为白藜芦醇,具有较高的应用价值。

2.1 果汁中应用

β-葡萄糖苷酶用作食品添加剂[57]作用于水果中的芳香前体物质,利于果汁脱苦和果汁增香。高倩[58]对廉江红橙果汁添加外源β-葡萄糖苷酶,增加了红橙果汁中3-蒈烯、安息香醛、环己醇等风味成分,改善了红橙果汁的风味,起到了增香的作用。王鹏等[59]对蟠桃汁进行β-葡萄糖苷酶酶解处理,蟠桃汁的桃果香、花清香、香甜味显著增加,不良风味属性(异味和蒸煮味)显著降低。张瑶等[60]采用气相色谱-质谱法对新鲜柠檬汁和β-葡萄糖苷酶酶解处理的柠檬汁的香气成分进行测定,发现酶解后柠檬汁的香气种类增加且酶解汁中香气成分总量增加了11%,不仅释放出新的香气物质,还对加工过程中损失的香气起到弥补作用。此外,β-葡萄糖苷酶也可用于果汁脱苦,可以有效地降低胡柚汁中柠檬苦素、柚皮苷等苦味物质,几乎不影响果汁中VC等营养成分[61]。

2.2 葡萄酒中应用

在葡萄酒的生产中,β-葡萄糖苷酶能够显著增加葡萄酒中的糖苷萜烯类前体物质的水解和单萜类物质的释放,在葡萄酒香气形成过程中起着重要作用[62]。Hu等[63]研究发现来自H.uvarum菌株的β-葡萄糖苷酶显示出对C13-异构体和一些萜类的芳香糖苷的催化特异性,在葡萄酒酿造中增强了葡萄酒中鲜花、甜味、浆果和坚果的香气特征。另外,添加β-葡萄糖苷酶的葡萄酒不仅使会单萜、酚类和降异戊二烯的浓度显著增加,且葡萄酒本身的成色物质几乎不会受到损失[64-65]。Hu等[66]研究发现来自微生物的一种新的β-葡萄糖苷酶显示出对苯基化合物和C13-异构体的糖苷的水解特异性,并且对酿酒条件表现出很强的耐受性,进一步改善葡萄酒的花香和水果香味特征。

2.3 其他

β-葡萄糖苷酶还可以应用于转化大豆异黄酮提高保健功能方面[67]。Baú等[68]优化豆浆加工中β-葡萄糖苷异黄酮向糖苷配基的转化研究,在豆浆加热中维持大豆黄素和染料木黄酮苷元含量,黄豆黄素和β-葡萄糖苷含量增加,丙二酰葡萄糖苷含量降低。Abdella等[13]将黑曲霉产生的β-葡萄糖苷酶水解大豆粉异黄酮糖苷,用Box-Behnken优化反应影响因素,确定染料木黄酮生产的有效变量,染料木素的浓度增加了11.73倍,发现生物转化使抗氧化活性增加了四倍。Pyo等[46]将β-葡萄糖苷酶添加到豆奶中,能够将较低的异黄酮糖苷物质有效转化为高活性的异黄酮苷元,其中苷元(大豆黄素+染料木黄酮)平均增加7.1倍。

近几年,β-葡萄糖苷酶在高生理活性的单体的生产方面应用备受关注,如白藜芦醇和人参稀有皂苷。β-葡萄糖苷酶可以将白藜芦醇苷水解为白藜芦醇,目的产物得率高,具有较可观的工业化应用前景。Gaensly等[69]筛选了308个本地酵母菌株,其中Hanseniasporauvarum生产的β-葡萄糖苷酶在发酵过程中显示出有效转化白藜芦醇葡萄糖苷的能力。冯薇等[70]对虎杖复合酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和虎杖苷专用酶进行白藜芦醇苷酶解制备白藜芦醇的工艺,发现β-葡萄糖苷酶的转化效果最好。Zhou等[15]将虎杖通过β-葡萄糖苷酶的酶促切割而产生白藜芦醇,几乎所有虎杖中的白藜芦醇苷都转化为白藜芦醇。

β-葡萄糖苷酶可以有效的水解人参皂苷,将大量的常见皂苷转化为稀有人参皂苷,是大量获得稀有人参皂苷的新途径[71]。Siddiqi等[47]利用β-葡萄糖苷酶的转移葡萄糖基的作用,可以将人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rg3。邵巍等[55]研究利用β-葡萄糖苷酶将人参皂苷Rb1的C-21位两个-GLc键水解,进而转化为稀有人参皂苷Rg3。

3 展望

微生物来源的β-葡萄糖苷酶资源的挖掘和酶学特性的分析已经取得了长足的进展,特别是在食品微生物来源的β-葡萄糖苷酶的特性和应用,越来越受到食品加工领域的关注,但仍存在一些问题亟待解决。第一:虽然关于微生物β-葡萄糖苷酶研究报道较多,但实际市售的β-葡萄糖苷酶的提取来源大多还是来源于杏仁,由于原料有限,其价格相对较高,要应用于大规模的食品工业,就单从成本考虑限制其应用。这说明微生物来源的β-葡萄糖苷酶虽然有巨大的开发价值,但是由于其产酶量少,活性低,大大限制了研究成果的转化。进一步结合基因工程等现代生物技术,挖掘高活性β-葡萄糖苷酶微生物和优化价格低廉的生产工艺将是亟待解决的问题。第二:与其他来源的酶相比,β-葡萄糖苷酶底物特异性较广泛,而在大多数研究中发现其最适底物基本为p-NPG,对其他类型的β-葡萄糖苷键的底物亲和性相对较低,而p-NPG不是食品成分。因此,寻找对自然底物更强特异性的β-葡萄糖苷酶,挖掘潜在的生物学功能是目前的重要挑战。第三:β-葡萄糖苷酶在食品风味改良方面的研究已经普遍得到认可,但是目前应用领域多限制在葡萄酒和茶叶的增香方面。与人工添加的芳香物质相比,酶解产生的风味物质更具有安全性,能满足消费者对食品原汁原味的需求。拓宽β-葡萄糖苷酶的应用领域将促进β-葡萄糖苷酶的创新和研究发展,在食品工业中极具应用价值,为食品工业带来新的发展契机。