益生菌微胶囊技术及其在食品中的应用研究进展

田文静,孙玉清,刘小飞

(北京农业职业学院,北京 102442)

近年来,随着生活水平的不断提高,越来越多消费者关注食品的健康性。因此,“功能性食品”应运而生,并迅速成为食品工业的一个重要发展方向。功能性食品是指那些除能提供正常的营养价值之外,还可改善或影响机体功能的食品[1-2]。而益生菌食品是功能性食品中的一个重要组成部分[3]。诸多研究表明,益生菌作为人体肠道重要的生理菌,具有多种生理功能,包括改善人体肠道功能、减少肠道疾病、促进营养物质吸收、缓解乳糖不耐症、降胆固醇、调节免疫系统、预防癌症等[4-5],因此被广泛青睐。

为获得这些功效,使益生菌在产品和宿主中都保持活性和代谢稳定,且达到一定数量(通常认为产品中不低于107cfu/g或107cfu/mL)[6]尤为重要。然而,在加工、运输、贮藏以及消化过程中,益生菌往往会受到加工条件、贮藏温度、食品中其他成分及宿主消化系统(胃酸、胆盐、酶)等不良因素的影响,进而导致菌的数量和活性下降,或使最终定植于人体肠道中的活菌数低于理论上能够发挥益生功效的最小阈值[7]。因此,在食品加工中保持益生菌的活性和数量尤为重要。而微胶囊技术就是一种能有效保护益生菌抵抗不良环境的被广泛应用的技术手段[8-10]。

微胶囊化是指用天然或合成的高分子材料包埋微小的固体颗粒、液滴或气体,形成粒径为几微米至几毫米、具有半透性或密封性囊膜粒子的过程[11]。其中,包裹在微胶囊内部的物质称为芯材,外部的囊膜称为壁材。在食品工业中,微胶囊化有多种目的,其中最主要的是为芯材提供物理屏障,进而保护其不受或减少外界环境的影响,直至到达终点——人体肠道[11-13]。由于益生菌在肠道中的定植量被认为是益生菌发挥功能的前提,故微胶囊中的益生菌能否在肠道中完全释放也是判断微胶囊品质好坏的一个重要标准[14]。此外,为避免益生菌微胶囊的添加对功能性食品的风味、口感、质地等产生影响,微胶囊的粒径也应控制在足够小的范围内。

目前,尽管对益生菌微胶囊的研究较多,但是在现今的技术方案中仍有很多明显的技术障碍,要将其应用于食品工业中,尚有很多缺陷和技术难题需要解决。基于此,本文探讨了益生菌微胶囊常用的制备方法及不同壁材对微胶囊质量评价的影响,并对其在酸奶、奶酪、冰淇淋等食品中的应用情况进行了综述,同时对其未来的发展前景进行了展望。

1 微胶囊化技术

目前,在食品工业中应用最多的微胶囊制备方法有挤压法、乳化法和喷雾干燥法等。

1.1 挤压法

挤压法是制备益生菌微胶囊最简单、最常用的方法,是指将益生菌加入壁材溶液中混合均匀,并通过喷嘴以液滴的形式滴入固化液中形成微小颗粒的过程[15]。例如,在最常见的以海藻酸钠为壁材的微胶囊中,固化液通常为CaCl2溶液[16]。由于该方法操作简单、成本低廉,所以在益生菌的包埋过程中应用较广,但缺点是得到的胶囊粒径较大,约为0.5～3 mm[16]。Krasaekoopt等[17]以海藻酸钠与壳聚糖为壁材,采用挤压法制得的微胶囊平均粒径为1.89 mm。用挤压法制得的微胶囊的粒径大小取决于喷嘴孔径的大小、液滴下落的距离、固化液的选择以及壁材-细胞混合液的粘度等[18]。为了减小微胶囊的粒径,Doherty等[19]以乳清蛋白为壁材,以醋酸盐溶液为固化液,并在固化液中加入吐温-20以减小表面张力,最终制得的微胶囊平均粒径为200 μm。

1.2 乳化法

从灵活地控制和调整微胶囊大小方面考量,制备益生菌微胶囊最合适的方法是乳化法。具体操作方法是先将益生菌与壁材混合均匀,后加入到植物油中进行乳化,待形成均匀且稳定的油包水(W/O)乳化液后,加入交联剂,使壁材与之反应固化成型,同时将益生菌包埋其中而形成益生菌微胶囊[16]。影响微胶囊粒径大小的主要参数有乳化过程中的能量输入、乳化剂的加入、分散相与连续相的黏度比以及搅拌速度等,用乳化法制得的微胶囊粒径通常较小,约为20 μm～2 mm,但不足是在搅拌器强大剪切力的作用下,得到的微胶囊形状可能不规则,呈球形较差[20]。Heidebach等[21]以乳蛋白为壁材,运用内源乳化法对副干酪乳杆菌F19和乳双歧杆菌Bb12进行包埋,得到的微胶囊粒径为(165±23) μm,但微胶囊的呈球形较差。

1.3 喷雾干燥法

益生菌在加入食品后直至被食用之前往往要储存一段时间,因此,益生菌微胶囊在制备好后通常要进行干燥处理,运用挤压法或乳化法制得的微胶囊常用冷冻干燥法进行干燥[22-24]。而另一种方法可以在单步中同时实现微胶囊的制备和干燥,即喷雾干燥法。

在食品工业中,喷雾干燥是将液体转化为干粉的一个常见操作,近年来,该技术也广泛的应用于益生菌微胶囊的制备,具体操作是将益生菌与壁材混合均匀后,通过喷雾干燥器进行雾化、干燥得到微胶囊的过程。用该法制得的微胶囊形状比较均匀,呈球性较好,且粒径也较小(往往小于100 μm)[20]。然而,与以挤压法和乳化法制得的微胶囊相比,用喷雾干燥法制得的微胶囊大多是水溶性的。因此,在加入食品后或进入胃肠液消化的过程中可能会过早地释放益生菌,而不能对其形成有效的保护[16]。此外,在喷雾干燥过程中,较高的温度和瞬间脱水可能会导致细胞退化,进而使活菌数大幅减少或对不良环境的抗性明显下降[25]。有研究表明,在喷雾干燥过程中,喷雾干燥出口的温度对微胶囊中的活菌数及其贮藏性有显著影响,而降低出口温度可以明显改善[26-28]。Desmond等[29]以牛乳和阿拉伯胶为壁材,运用喷雾干燥法制备副干酪乳杆菌NFBC 338微胶囊,进出口温度分别为170 ℃和100～105 ℃时制得的微胶囊含水量为2.53%±0.55%,在4 ℃下贮藏8周后存活率仅为18.7%±3.8%;若将出口温度设置为95～100 ℃时,制得的微胶囊含水量为2.76%±0.68%,同样条件下贮藏8周后存活率为67.9%±2.0%。因此,选择出口温度的时候,要充分考虑益生菌的存活量和干燥产品的含水量要求(通常要求干燥微胶囊的含水量低于10%)[30]。

2 益生菌微胶囊的评价指标及壁材对其质量的影响

2.1 包埋率

包埋率通常指制得的微胶囊中所含活菌数(CFU)与最初添加到壁材溶液中的活菌数(CFU)之比。因此,包埋率是一个描述活细胞存活率和包埋过程中包埋效率的参数。在实际操作中,包埋率通常都小于100%,其主要原因是包埋过程中的不良环境(如加热、剪切力、浓溶液的应用等)对微生物细胞损伤造成的;此外,在加入固化液发生交联的瞬间,也会发生大量细胞未被包埋而造成损失的现象。在测微胶囊中所含活菌数的时候需要将其崩解,释放菌体进行测量计算,而崩解不完全或解离过程中,受不良因素的影响均会导致所测微胶囊包埋率的下降[31]。例如,以海藻酸钠为壁材的微胶囊可以在磷酸盐缓冲液中轻微振荡实现崩解[32];而对于不可逆凝胶形成的微胶囊,通常需要机械分解的方法去实现崩解,在崩解过程中很容易造成益生菌活菌数下降,进而影响包埋率。

在益生菌食品中,每克或每毫升产品中益生菌数大于106～107CFU才被认为是有效的[9]。因此,为使产品中益生菌含量达到最低要求剂量,尤其是在微胶囊添加比例较低的情况下,微胶囊必须有较高的包埋率。然而,现在很多研究者为满足益生菌微胶囊在食品中的要求(如较小的粒径、更适合应用于食品的壁材等),对现有的包埋方法进行调整,包埋率下降的问题却又随之出现。

2.2 不同壁材对益生菌微胶囊质量评价的影响

2.2.1 胶质壁材 在益生菌微胶囊的制备中,以胶质材料(如海藻酸钠、卡拉胶、结冷胶、黄原胶、阿拉伯胶等)做为壁材的研究非常普遍,原因是胶质壁材在水溶液中或与离子键合后,会形成有一定机械强度的凝胶粒子,同时对其中的益生菌形成保护作用[33]。但由于胶质材料的水溶液粘度较大,易造成益生菌分散不均,以及微胶囊粒径较大等问题。针对此类问题,很多研究者对制备方法进行了改进,使微胶囊粒径控制在较小范围,但与此同时,也可能对包埋率等造成不良影响。

傅玉鸿等[34]以海藻酸钠、黄原胶和壳聚糖为壁材,运用挤压法包埋海洋放线菌,得到的微囊有良好的机械强度,但粒径却高达400～650 μm。Capela等[35]在磁力搅拌器的作用下,运用乳化法将益生菌包埋于3%海藻酸钠中,得到的微胶囊平均粒径为381 μm。由于用作微胶囊壁材的海藻酸钠属于胶体溶液,即使在低浓度下粘度也较高,造成分散相和连续相(绝大多数为植物油)间粘度比相对较高,所以,为使微胶囊的粒径足够小,必须在乳化过程中提高能量输入。在后续试验中,Capela等[35]通过高压均质机或高速搅拌器等设备在乳化过程中提供高剪切力,最终得到的微胶囊粒径减小至100 μm以下,但包埋率却显著下降,可能是由于均质或高速搅拌过程中产生的热应力或机械力导致益生菌存活率有所下降。Ding等[36]以海藻酸钠为壁材,在乳化过程中运用均质机或微流化器提供剪切力以减小微胶囊的大小,结果发现,用此方法制得的8种益生菌微胶囊中菌的包埋率普遍降低0.5～3.5个对数值。

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由此可见,为将益生菌微胶囊更好地应用于食品工业中,应在控制其粒径的情况下充分考虑包埋率,故对新型壁材的探究及对制备方法的改进是今后的重要发展方向。

2.2.2 蛋白壁材 目前,以蛋白质作为微胶囊壁材的相关报道也较多。由于蛋白质具有良好的乳化特性和较低的粘度,若以此为壁材,采用乳化法可以以较小的剪切力制得粒径小、包埋率高的微胶囊[37]。此外,与上述的胶质材料相比,大多数蛋白溶液即使在高浓度下也有相对较低的粘度,这更有利于微胶囊形成致密的网络结构,对内部益生菌形成的保护更为有效。

然而,以蛋白质替代常用的胶质材料作为益生菌微胶囊的壁材,有时需要对现有的微胶囊化技术进行优化甚至创建新的方法,但在实际操作中也可能会产生其他问题。Annan等[31]采用共价交联的凝胶机制制备青春双歧杆菌微胶囊,其平均粒径为50 μm,但包埋率仅为41.43%,可能是由于共价交联产生的强大物理稳定性阻止了内部菌体的完全释放,使计算所得的包埋率较低,但是,由包埋过程本身引起的包埋率下降程度却难以评估。Picot等[38]以40 ℃下热变性的乳蛋白为壁材,分别与多种双歧杆菌混合均匀后进行喷雾干燥,产生的微胶囊粒径为3～75 μm,包埋率为0.71%～25.7%,且不同菌种的包埋率取决于其本身的耐热性,因此,较高的剪切力和热失活引起的细胞损伤是该方法的主要缺陷。Weinbreck等[39]也表示干燥过程中的高温处理对菌体细胞有所损伤。而Heidebach等[37]采用乳化法,用凝乳酶交联酪蛋白对副干酪乳杆菌F19和双歧杆菌Bb12进行包埋,发现包埋率分别可以达到70%和93%,原因可能是凝乳酶与乳清蛋白的交联使微胶囊结构更加致密,对益生菌提供的保护更加有效。

在食品工业中,为使其与功能性食品的特定要求相匹配,常需要对微胶囊制备方法进行优化。然而,根据上述研究可以看出,为减小微胶囊的粒径,对一些操作方法的优化可能会导致包埋率降低。但使用蛋白质溶液代替胶质材料作为壁材,如果采用温和的凝胶机制(如用凝乳酶交联乳清蛋白等),可以获得粒径较小且包埋率较高的微胶囊[40]。

2.2.3 油脂壁材 除了碳水化合物和蛋白质外,以脂质作为益生菌微胶囊壁材的相关研究较少。其具体操作方法是将益生菌与熔融脂质混合均匀,随后冷却结合,实现将益生菌包埋于脂质壁材中的目的。然而,益生菌在油中均匀的分散是一个技术难题[41]。其次,由于脂质的融点较低,以脂质为壁材形成的微胶囊在人体胃肠道中,会过早融化释放出益生菌,从而降低对益生菌的保护作用。此外,考虑到脂质微胶囊难以分离的现状,其应用范围大大降低,目前多应用于固体食品[42]。Lahtinen等[42]发现,将益生菌包埋于可可油后添加至发酵或未发酵的燕麦饮品中,在贮藏过程中,只有轻微的保护作用。Modler等[43]将益生菌包埋于乳脂后添加至冷冻酸奶,发现在贮藏过程中其对益生菌几乎没有保护作用。因此,与胶质材料和蛋白质相比,油脂作为益生菌微胶囊化的壁材还需进一步研究。

3 益生菌微胶囊在食品中的应用及对产品特性的影响

对于益生菌微胶囊在食品中的应用来说,足够小的粒径是目前研究中最主要的重点之一。一方面,微胶囊粒径越大,相应的比表面积会越小,与空气等外界不良环境接触也相应减少,增大了保护的可能性[18];另一方面,添加至食品的微胶囊必须足够小,否则会对食品的感官性质产生不良影响[12]。这些冲突可能会造成益生菌微胶囊在食品中的应用遇到困难。

感官学研究结果表明,与小的、柔和的、呈球性较好的粒子相比,大的、坚硬的、形状不规则的粒子会产生粗糙、坚硬和不愉快的感觉[44]。如在食品中,粒径约为10～20 μm的坚硬、不规则的糖晶体在数量较少的情况下就可被察觉到;但柔和、呈球性较好的粒子在感官检测中有更高的阈值水平,通常当粒径小于100 μm时,都不会给所添加的食品的感官造成不良影响[12,45]。

3.1 益生菌微胶囊在酸奶中的应用

表1 益生菌微胶囊在酸奶中的应用

从表1所示的研究可以得出结论,微胶囊可以显著提高益生菌在酸奶中的存活率,这种保护通常是由于微胶囊阻碍了益生菌与不良条件的接触,如发酵剂的代谢产物、H2O2、乳酸、细菌素等,此外,氧气的存在及低pH等条件都是导致酸奶中益生菌存活率降低的原因[55-56]。Talwalkar等[57]研究表明,在有氧条件下,海藻酸钠微胶囊可以为多种益生菌提供实质性保护,因此,在酸奶中储存时,益生菌的存活率更高。但是,微胶囊的添加也很有可能对食品的感官产生负面影响。对表1中提到的这些产品的感官评估也证实了这一点。在Adhikari等[53]的研究中,感官分析显示,与含微胶囊相比,消费者更喜欢含益生菌裸菌的酸奶,感官评价员也认为含益生菌微胶囊的酸奶有明显的颗粒感,整体的可接受性更差。Kailasapathy[58]的感官分析报告称,与仅含益生菌的酸奶相比,含益生菌微胶囊的酸奶有轻微的颗粒感。

而王潆雪[49]的研究表明,添加游离或微胶囊化益生菌的酸奶在贮存期间,其外观、色泽及风味并无显著变化,微胶囊的添加使酸奶的质地(光滑程度)变化显著,原因是微胶囊化有助于益生菌产生胞外多糖,使酸奶黏度增加,防止了乳清的析出,故对酸奶的质地有所改善。但由于添加微胶囊的酸奶有轻微的沙砾感,因此不如其他两种酸奶受欢迎。

Mousa等[59]将两歧双歧杆菌F35包埋于乳清蛋白,然后用海藻酸钠进行双层包埋,添加至酸奶中贮藏7 d,微胶囊对双歧杆菌表现出良好的保护作用。但感官评价结果显示,双层微胶囊在酸奶中引起轻微的苦味和奶油质地。

综上,微胶囊化可以显著提高益生菌在酸奶中的存活时间和存活率,但益生菌微胶囊的添加也可能降低酸奶的感官特性。由于微胶囊的粒径、与溶液的相容性和酸奶的颗粒感直接相关,所以,在今后的研究中,微胶囊粒径的减小及壁材与酸奶基质的相容性应被进一步探究。

3.2 益生菌微胶囊在奶酪中的应用

除了酸奶,奶酪也常常作为益生菌微胶囊的目标载体(如表2)。Liu等[60]以乳清蛋白和异麦芽糖低聚糖的美拉德反应产物为壁材,对鼠李糖乳杆菌进行包埋,分别将得到的微胶囊和鼠李糖乳杆菌裸菌添加至奶酪中,贮藏90 d后发现,微胶囊化显著提高了鼠李糖乳杆菌在奶酪中的存活率,且微胶囊的添加对奶酪的感官性质没有影响。

表2 益生菌微胶囊在奶酪中的应用

Kadiya等[62]分别将干酪乳杆菌NCDC298和嗜酸乳杆菌NCDC15包埋至海藻酸钠-抗性淀粉微胶囊中,添加至夸克奶酪贮藏30 d后,发现微胶囊化对菌体的存活率分别提高了1.5和1个对数值,但对奶酪的感官性质没有显著影响(如风味、口感、质地、颜色以及奶酪在贮藏期间的表现等)。此外,Ozer等[64]也指出,在奶酪中添加益生菌微胶囊与添加裸菌在感官上没有明显差异。相反,Kailasapathy等[66]发现含益生菌和微胶囊的奶酪在风味上没有差别,但是在口感上,含微胶囊的奶酪有砂砾感。

Kailasapathy等[65]用Ca2+交联海藻酸钠和抗性淀粉同时将嗜酸乳杆菌DD910包埋其中,添加至菲达奶酪贮藏7周后,发现该方法制得的微胶囊在奶酪中对嗜酸乳杆菌DD910没有产生保护作用。可能是由于奶酪质地疏松、含盐量较高,而微胶囊在盐溶液中容易解离,削弱其对菌体的保护作用。同时,研究表明,微胶囊和嗜酸乳杆菌DD910裸菌的添加对奶酪的质构参数(如弹性、内聚力等)没有明显改变,但是,对奶酪的咀嚼性、粘弹性和硬度都有显著影响。故在今后的研究中,对微胶囊壁材的选择及对耐酸、耐盐、产胞外多糖的菌株的选择均是提高奶酪中益生菌存活率、奶酪质地的重要方向。

3.3 益生菌微胶囊在冰淇淋中的应用

冰淇淋作为一种低温储存的乳制品,也是益生菌微胶囊的理想载体,相关研究如表3。Zanjani等[67]以海藻酸钠-高直链玉米淀粉-壳聚糖混合液为壁材,分别对干酪乳杆菌ATCC39392和青春双歧杆菌ATCC15703进行包埋,得到的微胶囊粒径均为94 μm左右,包埋率约为96%。添加至冰淇淋,在-30 ℃下贮藏100 d后,微胶囊比裸菌的存活率分别提高了4和3个对数值。此外,感官评价显示,两种益生菌及微胶囊的添加对冰淇淋的质构、色泽、风味、口感等感官性质均没有显著影响。

表3 益生菌微胶囊在冰淇淋中的应用

Karthikeyan等[68]也探究了微胶囊化对益生菌在冰淇淋中应用的影响,分别将嗜酸乳杆菌LA-5和干酪乳杆菌NCDC-298包埋于海藻酸钙-乳清蛋白壁材中制得微胶囊,添加至冰淇淋,于-23 ℃下保存180 d后发现,与添加两种裸菌相比,微胶囊化使LA-5 和NCDC-298的活菌数分别提高2和3个对数值,而且,微胶囊的添加对冰淇淋的感官性质(包括颜色、口感、质地等)没有影响。同样El-Sayed等[69]表示,微胶囊的添加对冰淇淋的物理性质和感官性质没有显著影响。Homayouni等[71]也指出,微胶囊的添加对冰淇淋的感官没有负面影响。

3.4 益生菌微胶囊在其他产品中的应用

表4是益生菌微胶囊在其他食品中的应用,不同的食品基质在作为益生菌载体的适宜性方面也存在差异。

表4 益生菌微胶囊在其他产品中的应用

Patrignani等[72]分别将副干酪乳杆菌A13和唾液链球菌CET4063包埋于海藻酸钠微胶囊(包埋率分别为87%和83%,粒径<100 μm)中,并与两种裸菌分别添加至发酵牛乳中于4 ℃下贮藏45 d,发现微胶囊化分别使A13和CET4063的活菌数提高了0.9和0.6个对数值。且实验结果显示,微胶囊化可以调节益生菌的新陈代谢,避免产品过酸化,进而影响产品的感官性质;此外,由于其对胞外多糖释放的调节,发酵产品的质构参数(如硬度、相容性、粘结性、粘度指数等)也发生显著变化。总体来说,微胶囊化对发酵牛乳的功能性和感官特性均有提升作用。

Fahimdanesh等[73]的研究表明,益生菌微胶囊的添加改善了蛋黄酱的感官品质。Turhan等[74]将鼠李糖乳杆菌微胶囊添加至土耳其干发酵香肠,发现微胶囊的添加对香肠整体风味特征有提升作用。Mc等[75]的研究表明微胶囊的加入对饮料的风味和感官没有不良影响,可能是因为添加量仅为0.04%。Hansen等[45]表示微胶囊粒径足够小,以至于添加至牛奶中都没有粒状感,然而,与仅含益生菌裸菌的牛奶不同,含微胶囊的样品中有苦涩、尖锐的异味。

微胶囊能否成功地应用于食品中而不改变其感官特性,主要取决于微胶囊壁材与周围食品基质的相容性。在酸奶中添加微胶囊,往往会对其口感产生不良影响,而凝胶食品(如奶酪)或本身结构较粗糙的食品,似乎更适合于益生菌微胶囊的应用。

4 结论与展望

因此要将益生菌微胶囊成功地应用于食品中,必须满足以下条件:在微胶囊制作过程中应保证益生菌活细胞的数量;将益生菌微胶囊添加至食品后,应尽量保证不对食品的感官性状或风味产生不良影响;应在食品加工或贮藏过程中为益生菌提供保护作用;应在胃酸环境中保持益生菌细胞活性稳定,并在肠道中迅速释放。而目前为止,大多数益生菌微胶囊都未能全部满足这些要求。因此,对益生菌微胶囊化的新方法和新壁材的开发是至关重要的。

同时,对益生菌进行微胶囊化是为了提高益生菌在加工、贮藏、运输以及消化过程中对不良环境的抗性,但最终目的是使其以较高的活菌数定植于肠道中,并在人体中发挥益生功效。但目前,绝大多数研究只停留在微胶囊的工艺及在体外模拟胃肠液中的探究,而人体要比模拟环境复杂得多,因此,微胶囊对益生菌保护作用的体内验证及对其在体内产生功能效应的检测是十分重要且必要的。

此外,由于微胶囊中益生菌密度较大,可能会引发复杂的相互作用,甚至导致基因表达改变[77]。如Lamboley等[78]的研究证实,一些乳酸菌包埋于海藻酸钠微胶囊后,其形态发生了改变,但这些现象可能造成的结果没有被继续探究。这也是今后相关研究应该考虑的方面。