五味子多糖对对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝细胞凋亡的影响

车金营,杨 硕,乔子敬,杨雪晗,李 贺,孙靖辉,陈建光,王春梅

(北华大学药学院,药理教研室，吉林吉林 132013)

药物性肝损伤(Drug-induced liver injury,DILI)通常指肝脏受药物及其代谢产物毒性损伤或超敏反应引起的疾病,是当前急性肝损伤最为常见的病因之一,严重者可导致急性肝衰竭甚至死亡[1]。最新的研究表明,每年DILI在我国普通人群中的发病率至少为23.80/10万人,占药物不良反应的10%左右,因此防治DILI对降低临床肝病的发生率具有重要意义[2]。对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)是临床常用的解热镇痛药,过量摄入可使肝细胞中产生大量的代谢产物——N-乙酸-对苯醌亚胺,耗竭谷胱甘肽(Glutathione,GSH),引起氧化应激及线粒体损伤,致使肝细胞发生凋亡及坏死,是建立急性DILI模型常用的工具药,也是引起急性DILI的最常见原因之一[3]。

五味子(Schisandrachinensis(Turcz)Baill)为我国传统保肝药物。有研究表明五味子发挥护肝作用的主要成分是其脂溶性成分木脂素类[4]，但中医药的传统使用方法为水煎,提示其水溶性成分是具有药理活性的。近年来五味子多糖(Schisandrachinensispolysaccharide,SCP)的降酶护肝、促进肝脏再生等作用研究越来越受到关注[5]。课题组的前期研究已证实SCP对酒精、CCl4、高脂饮食等诱导的肝损伤都有一定的保护作用,且具有显著的抗氧化活性[6-10]。目前,SCP对APAP致急性DILI保护作用的研究鲜有报道、其作用机制也尚不明确。

因此,本实验采用一次性腹腔注射APAP诱导的小鼠急性严重肝损伤模型,进一步观察SCP对急性药物性肝损伤的保护作用,同时探讨SCP是否通过抑制APAP诱导的肝细胞凋亡而发挥保护肝损伤作用,以期为今后五味子的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

五味子 吉林省集安五味子种植基地;氨基磺酸、间羟基联苯 美国Sigma公司;葡萄糖、无水乙醇 北京市化学试剂公司;苯酚、浓硫酸 国药化学试剂集团,分析纯;对乙酰氨基酚(批号A105808-25g) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;雄性ICR 小鼠50只,体重19～22 g,长春伊斯实验动物技术有限公司(合格证号:SCXK(吉)2016-0004);丙氨酸氨基转移酶(ALT)、丙二醛(MDA)、天冬氨酸转氨酶(AST)苏木精和伊红(HE)染色试剂盒、谷胱甘肽(GSH) 南京建成生物工程研究所;Hoechst 33258染色、ECL显影液及BCA蛋白定量试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司;HCL-Tris、30%丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵及甘氨酸 北京鼎国试剂公司;脱脂奶粉 美国BD公司;p-JNK、JNK、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Caspase-3抗体 武汉ABclonal公司。

Shimadzu HPLC系统(LC-10ATvp泵和SPD-10AVD紫外光检测器)、Thermo ODS HYPERSIL高效液相色谱柱 日本岛津公司;Infinite M200酶标仪 瑞士Tecan集团;Western blot电泳仪、电转仪 美国Bio-Red 公司;Nikon Eclipse Ti-SR倒置荧光显微镜 日本Nikon公司。

1.2 实验方法

1.2.1 五味子多糖制备 称取五味子干燥果实1.5 kg,加入10倍量蒸馏水浸泡24 h,煮沸2次(3+2 h),合并提取液并以80 ℃浓缩至2 L,将浓缩液离心(4500 r/min,15 min),弃去沉淀。向上清液中加入95%乙醇,使乙醇终浓度为75%(用酒精计测定),沉淀24 h,离心(4500 r/min,15 min),收集沉淀。将沉淀依次用95%乙醇和无水乙醇洗涤,水浴蒸干,得粉末状SCP[6]。按照式(1)计算SCP得率。

SCP得率(%)=SCP质量(g)×100/五味子质量(g)

式(1)

1.2.2 五味子多糖化学组成分析 配制0.01 mg/mL葡萄糖溶液绘制标准曲线,采用苯酚-硫酸法测定糖含量[11];应用间羟基联苯法测定SCP中糖醛酸的含量[12];考马斯亮蓝法测定蛋白含量[13];1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化和高效液相色谱法(HPLC)进行单糖组分分析[14]。HPLC法采用Shimadzu HPLC系统(LC-10ATvp泵和SPD-10AVD紫外检测器),DIKMA Inertsil ODS-3 色谱柱(4.6×150 mm),流动相为0.1 mol/L的PBS,pH7.0-乙腈82∶18 (v/v),流速1.0 mL/min,35 ℃检测,进样量20 μL,检测波长为245 nm。

1.2.3 APAP诱导小鼠急性肝损伤模型的建立及分组 将雄性ICR小鼠50只,分为5组,分为对照组(CON)、肝损伤模型组(MOD)和25、50、100 mg/kg SCP组,每组10只。SCP各给药组给予相应剂量的SCP,CON组及MOD组给予同体积的生理盐水,连续灌胃2周,每天一次。末次给药后1 h,MOD组及SCP各给药组小鼠一次性腹腔注射APAP(250 mg/kg),CON组以相同方式给予生理盐水[15]。所有小鼠均禁食不禁水。24 h后眼球取血,3500 r/min,4 ℃离心5 min,分装血清。将小鼠断髓处死,小心取出肝脏,生理盐水清洗后滤纸吸干水分,观察肝脏整体形态,称量并按照式(2)计算肝指数:随后将肝组织一部分用福尔马林固定,另一部分保存于-80 ℃冰箱中。

肝指数(mg/g)=肝质量(mg)/体质量(g)

式(2)

1.2.4 小鼠血清中ALT、AST及肝组织中GSH、MDA水平检测 采用酶法检测小鼠血清中ALT及AST水平;另取肝组织100 mg,加入9倍量的生理盐水于冰水浴中制成10%组织匀浆,3500 r/min离心10 min,取上清液,采用二硫代对硝基苯法和硫代巴比妥法试剂盒测定GSH及MDA水平[6]。所有检测方法均依据南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行测定。

1.2.5 HE染色 取福尔马林固定的肝组织,经石蜡包埋、切片,进行苏木精-伊红(HE)染色,观察肝细胞病理形态变化[9]。

1.2.6 Hoechst 33258染色 将5 μmol/L的石蜡切片脱蜡水化后,根据Hoechst 33258染色试剂盒的说明进行染色,并在倒置荧光显微镜下观察染色的细胞核[15]。在显微镜高倍视野下随机选取3个区域,以计算阳性肝细胞数及肝细胞总数。根据式(3)计算。

肝细胞凋亡率(%)=阳性肝细胞数×100/肝细胞总数

式(3)

1.2.7 Western blot 法检测凋亡相关蛋白表达水平 将冻存的肝组织取出,加入裂解液,冰上裂解1 h,离心(4 ℃、12000 r/min、10 min)收集上清液。采用BCA法测定样本蛋白浓度,在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离目标蛋白,电转移至PVDF膜2 h,随后用封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液)封闭1 h。室温孵育后弃去封闭液,加入p-JNK、JNK、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Caspase-3第一抗体(1∶1000)4 ℃过夜[10]。次日用TBST缓冲液洗涤3×10 min,并与第二抗体(1∶5000)室温下孵育1 h,TBST缓冲液洗涤3×10 min,最后加入ECL显影液,并在化学发光仪器上观察条带并通过图像分析分析结果。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 五味子多糖化学组成分析

本研究采用经典的水提醇沉法制备五味子多糖[7],由表1可知,SCP得率为8.55%,糖含量为40.60%,糖醛酸含量为24.70%,蛋白质含量为1.51%。从单糖组成分析结果显示SCP中葡萄糖和半乳糖醛酸的含量较高,分别占38.00%及36.70%,其次是半乳糖、阿拉伯糖及鼠李糖,分别占12.00%、7.30%、4.00%,同时还含有少量的甘露糖,约占1.20%。

表1 五味子多糖的化学组成分析(%)

2.2 各组小鼠肝质量及肝指数

肝指数的变化通常能够反映肝组织是否肿大、萎缩,也是反映肝组织损伤程度的指标之一[16]。由表2可知,与CON组相比,MOD组小鼠肝质量和肝指数显著升高(p<0.05),说明一次性腹腔注射250 mg/kg APAP可引起肝组织水肿,肝损伤造模成功。而与MOD组相比,50及100 mg/kg SCP组小鼠的肝质量及肝指数均显著下降(p<0.05),而25 mg/kg SCP组下降不显著(p>0.05)表明适当剂量的SCP能够减轻APAP引起的肝组织水肿,保护肝损伤。

表2 各组小鼠肝质量及肝指数(n=10)

2.3 各组小鼠血清中ALT、AST及肝组织中GSH、MDA水平

肝脏是药物在体内代谢的主要场所,最容易受到药物的影响[17]。当肝细胞受损时,细胞内的ALT和AST被大量释放到血液中,使血液中酶活性显著增加。因此,血清中ALT和AST水平被认为是反映肝脏受损的敏感指标[18]。由表3可知,与CON组相比,MOD组小鼠血清中ALT、AST水平极显著升高(p<0.01),表明一次性大剂量注射APAP可使小鼠肝细胞损伤。而与MOD组相比,25及50 mg/kg SCP组小鼠血清中ALT、AST水平显著降低(p<0.05),100 mg/kg SCP组小鼠血清中ALT、AST水平极显著降低(p<0.01),表明SCP对APAP诱导的急性肝细胞损伤具有一定的保护作用。

相关研究表明:过量的APAP经肝脏CYP450酶代谢产生大量的代谢产物,致使肝细胞内GSH快速消耗,产生氧化应激进而引起肝细胞损伤[19]。由表3可知,与CON组相比,MOD组小鼠肝组织中GSH水平显著下降(p<0.05),MDA水平显著升高(p<0.05),表明小鼠机体的抗氧化能力显著下降。而与MOD组相比,50 及100 mg/kg SCP组肝组织中GSH水平显著升高、MDA水平显著降低(p<0.05),表明SCP可以通过提高机体抗氧化能力改善APAP诱导的小鼠急性肝损伤。

表3 各组小鼠血清中ALT、AST及肝组织中GSH、MDA水平(n=10)

2.4 各组小鼠肝脏形态及组织病理学

由图1可知,观察小鼠解剖后的肝脏,CON组小鼠肝脏颜色为红褐色,表面光滑。MOD组小鼠肝体积增大,局部点状区域呈土黄色,显示肝组织部分坏死。组织病理学显示:CON组小鼠肝小叶结构完整,肝细胞形态正常,肝索排列规则。MOD组小鼠肝小叶结构紊乱,中央静脉附近出现炎性浸润及部分变性坏死,肝细胞胞浆疏松化。表明APAP诱导小鼠急性肝损伤模型建立成功。

图1 各组小鼠肝脏病理学形态比较

与MOD组相比,SCP各给药组小鼠解剖后的肝脏颜色及组织坏死程度介于MOD组与CON组之间,均有不同程度的变化。组织病理学显示SCP各给药组小鼠肝索排列趋于整齐、肝细胞形态明显好转,中央静脉附近的炎性浸润及变性坏死较MOD组明显减少。表明SCP可改善APAP诱导小鼠肝组织病理学变化。

2.5 各组小鼠肝细胞凋亡现象

为了进一步探讨SCP是否抑制APAP诱导的肝细胞凋亡,采用Hoechst 33258染色观察了肝细胞的凋亡情况。结果由图2a可知,CON组肝细胞排列整齐,规则,形态良好,几乎没有亮蓝色浓染的细胞,MOD组的中央静脉的肝细胞核呈现出明亮的致密性浓染,细胞核固缩,表明过量的APAP可以使小鼠肝细胞凋亡增加。SCP各给药组肝细胞内亮蓝色浓染均不同程度减轻,且程度介于MOD组及CON组之间。CON组、MOD组、25、50及100 mg/kg SCP组的肝细胞凋亡率依次为16.56%、57.83%、39.45%、32.29%和23.71%。由图2b可知,与CON组相比,MOD组细胞凋亡率极显著增加(p<0.01);而与MOD组相比,25 和50 mg/kg SCP组细胞凋亡率显著降低(p<0.05),100 mg/kg SCP组肝细胞凋亡率极显著降低(p<0.01)。这些结果表明SCP对APAP诱导肝损伤的保护作用可能是通过抑制细胞凋亡实现的。

图2 各组小鼠肝组织细胞凋亡情况(a)及肝细胞凋亡率(b)(100×)

2.6 Western blot 法检测小鼠凋亡蛋白表达水平

Baek[20]等研究发现,APAP介导细胞凋亡的Caspase通路是其造成急性肝损伤的必要途径。为了探讨SCP抑制APAP诱导肝细胞凋亡的机制,进一步检测肝组织中Cleaved caspase-3、促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况。由图3可知,与CON组相比,MOD组Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达水平极显著升高(p<0.01),且Bcl-2的表达水平极显著降低(p<0.01),表明过量的APAP可激活凋亡通路相关蛋白,促进细胞凋亡。而与MOD组相比,25和50 mg/kg SCP组Bax蛋白表达显著降低(p<0.05),100 mg/kg SCP组Bax蛋白表达极显著降低(p<0.01),SCP各组Cleaved caspase-3表达极显著降低,Bcl-2表达极显著升高(p<0.01)。表明SCP可显著抑制APAP诱导的凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-3表达量的增加以及Bcl-2表达的降低。同时,有研究表明在过量APAP造成肝损伤的过程中,JNK被磷酸化激活并进入线粒体是关键步骤[21],而JNK磷酸化后能够影响Bcl-2家族相关蛋白表达,Bcl-2会阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质,抑制Caspase家族的级联反应[22]。结果由图3B可知,与CON组相比,MOD组p-JNK表达水平极显著增加(p<0.01);表明过量的APAP会激活JNK,使其磷酸化增加。与MOD相比,50及100 mg/kg SCP组p-JNK蛋白表达水平显著降低(p<0.05),25 mg/kg SCP组p-JNK蛋白表达水平降低不显著(p<0.05)。这些结果表明SCP可能通过阻断JNK的磷酸化,进而抑制APAP引起的细胞凋亡。

图3 各组小鼠肝组织p-JNK、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表达情况

3 结论

本研究采用一次性给予小鼠APAP(250 mg/kg)建立急性肝损伤模型,观察SCP对APAP诱导小鼠肝损伤的保护作用及对肝细胞凋亡的影响。结果显示:SCP可明显降低小鼠肝脏指数,血清转氨酶水平,改善肝脏病理变化,对APAP诱导的DILI具有显著的保护作用。SCP能显著减少MDA含量、缓解GSH的消耗,提高了机体的抗氧化能力。进一步研究发现SCP能显著降低肝组织中Cleaved caspase-3、Bax及升高Bcl-2的蛋白表达,说明SCP对APAP诱导的细胞凋亡具有抑制作用,其作用机制可能与抑制JNK信号通路的激活有关。本研究证实了SCP对APAP诱导的小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用,这为五味子的深入研究及开发利用提供一定的理论基础。