核酸适配体生物传感器在食品霉菌毒素检测中应用的研究进展

乔勤勤,文 芳,郑 楠,薛秀恒,程建波,张 昊,李松励,王加启

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室, 农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室(北京),北京 100193; 2.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽农产品加工工程实验室,安徽合肥 230036;3.安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥 230036)

霉菌毒素是由霉菌产生的次级代谢物,通过污染饲料和动物性食品(肉、蛋、奶等),对动物生产性能以及人类的组织和器官产生极大的危害[1-2]。谷物在生长、收获、储藏或加工过程中容易被霉菌毒素污染,世界上每年大约有 25% 的谷物遭受霉菌毒素的污染,严重影响人们健康饮食同时也造成巨大的经济损失[3-4]。食品中霉菌毒素污染已成为我国乃至全世界重点关注的问题之一,所以研发出简便、快速、灵敏的霉菌毒素检测方法对于食品安全和检测方面具有重要意义。近些年来,核酸适配体检测技术因具有高亲和力、高特异性、稳定性好、易修饰等优点得到快速发展,目前已经研发出的核酸适配体检测方法成功应用于食品中霉菌毒素的检测[5]。

本文介绍了我国和其他国家对食品中部分霉菌毒素的限量规定及其危害,简要概括了基于SELEX技术筛选核酸适配体的过程,详细地叙述了基于核酸适配体的生物传感器在食品中检测霉菌毒素的相关应用,总结出核酸适配体研究现状,进一步指出该研究现状的发展趋势以及对后续研究的借鉴意义。

1 食品中霉菌毒素限量规定及其危害

目前有400多种已知的霉菌毒素对人类和动物具有潜在毒性,常见的霉菌毒素主要包括黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1,AFM1)、赭曲霉毒素(Ochratoxin A,OTA)、伏马菌素(Fumonisin B1,FB1)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)以及T-2毒素(Mitsubishi T-2)[6-7]。霉菌毒素是人类健康的主要威胁之一[1],AFB1是一种高毒性的食品污染物,已被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)列为第1类致癌物[8-9]。OTA对大多数哺乳类动物有高度的致肝癌、致肾癌、致突变和致畸形等[10]。ZEN及其代谢物会影响雌性激素分泌,尤其是在哺乳动物生殖过程中[11]。T-2毒素可抑制蛋白质以及DNA和RNA的合成[12]。因为在自然条件下霉菌毒素天然存在,所以农作物在加工、运输和储存中容易被霉菌毒素污染[13]。因此,只要条件(湿度和温度)合适,霉菌毒素会污染食品、农作物和饲料[14]。对含有相对较高霉菌毒素水平的母牛饲料的研究表明,霉菌毒素及其代谢产物可转移到相应的食品中[15]。为了保护消费者的健康和减少经济损失,我国标准GB 13078-2017[16]中明确规定奶牛饲料中霉菌毒素最大残留限量(表1),标准GB 2761-2017[17]对食品中部分霉菌毒素的限量做出了相关规定(表2),欧洲委员会(European Commission)[18]和国际癌症研究组织[19]规定了大多数食物中霉菌毒素限量标准(表3)。

表1 我国标准GB 13078-2017中规定奶牛饲料中霉菌毒素最大残留限量

表2 我国标准GB 2761-2017规定了食品中部分霉菌毒素的限量

表3 欧洲委员会和国际癌症研究组织对部分霉菌毒素的限量规定

2 霉菌毒素检测方法

2.1 霉菌毒素传统检测方法

传统检测霉菌毒素的方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)和质谱法(MS)等仪器分析方法以及基于抗体的酶联免疫反应(ELISA)、免疫传感器和表面等离子共振(SPR)等免疫分析方法[20-24]。仪器分析方法具有较高的灵敏度、特异性和重复性等优点,免疫分析方法操作便捷、快速以及样品需要少等,但这些检测方法仍然存在一些问题,比如在仪器分析方法在样品前处理过程中,步骤繁杂、耗时长且不适合现场操作,同时需要大量的专业技术人员,而免疫分析方法中使用的抗体价格昂贵且不稳定,制备时间长,不容易长期存储,检测的结果容易出现假阳性、假阴性等[25-26]。所以研发出简单、便捷、灵敏的霉菌毒素的检测方法显得尤为重要。

2.2 霉菌毒素生物传感器检测

目前,基于核酸适配体的生物传感器因具有易合成、易标记、易修饰、灵敏度高、特异性高、分子量小、检测成本低等优势而受到广泛的关注[27-28]。国际理论与应用化学联合会(IUPAC)对生物传感器的定义为利用全细胞、细胞器、组织、酶或免疫制剂等生物识别元件的特异性生化反应,借助电、光、热等各种信号对化学物质进行检测的一类装置[29]。其优点是特异性好、灵敏度高、检测快速、样品前处理简单且可操作性强,在食品分析、医学检验、环境监测、工业检测与控制等领域具有广泛的应用[30]。最常用的生物识别元件为核酸适配体、抗体和酶[31-32]。

2.3 生物传感器中核酸适配体的筛选

核酸适配体是在体外筛选,能高亲和力和高特异性结合目标物的单链寡核苷酸序列(单链DNA(ssDNA)或RNA),最早由Tuerk等[33]发现,由Ellingtin等[34]命名。核酸适配体一般由20～100个核苷酸组成,其相对分子质量小、性质稳定、易穿透细胞膜,可通过重复的变性循环来维持其结构,可用于检测多种目标物,包括蛋白质、霉菌毒素、农兽药和金属离子等[35-38]。核酸适配体筛选技术基本上都是通过指数富集的配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)完成的,主要过程包括结合、分离、洗脱、扩增和调节[39]。几乎所有通过SELEX筛选的适配体在微摩尔(μmol)至纳摩尔(nmol)范围内的解离常数(Kd)都表现出高亲和力。因此,适配体也被称为“化学抗体”[40]。基于抗体的筛选方法具有操作简便、灵敏等优点,但在运输和储存过程中抗体稳定性较差的问题意味着该技术仅限于高度严格控制的环境中[41]。具有与抗体相似功能的核酸适配体,因具有成本低、稳定性高、易修饰、易合成、不需要活体动物或细胞、反复使用、可长期保存等优点,渐渐将抗体取代[42-43]。此外,当核酸适配体作为实时定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)中的模板,可使核酸适配体以指数形式扩增,以大大提高检测灵敏度[44]。因此,在许多生物学应用中,核酸适配体被认为是抗体的更好替代物[45]。

核酸适配体一般是通过SELEX筛选得到的,其筛选过程是从随机寡核苷酸文库开始,筛选的复杂度和多样性取决于其随机核苷酸的数目。在SELEX筛选过程中,随机寡核苷酸文库在pH、离子强度和温度的作用下暴露于靶标,与非结合物分离洗脱,对靶标具有亲和性的寡核苷酸进行PCR扩增。然后对从第一轮筛选产生的富集池进一步选择循环,用于增加反应池对靶标的亲和力(即正筛选)或消除可能与其它相关化合物交叉反应的成员池(即负筛选)。经过数轮筛选后,对富集的核苷酸文库进行测序和表征,通过测定Kd来评估适配体的亲和力,筛选出高亲和力的核酸适配体。在这些序列被测序之后,可化学合成大量高纯度的目的核酸适配体序列,以便并入感兴趣的生物传感器平台中,同时也可对靶标或者适配体进行各种的修饰,以便得到高灵敏、高选择的核酸适配体生物传感器[46]。随着分子生物学技术的快速发展,核酸适配体检测技术在食品安全检测、临床诊断、生物分析以及环境污染物监测等领域得到了广泛的应用,表4列举了目前文献中报道的常见霉菌毒素(AFB1、AFM1、OTA、FB1、ZEN)的核酸适配体序列。

表4 常见的霉菌毒素的核酸适配体序列

3 基于核酸适配体的生物传感器检测食品中霉菌毒素的方法

食品中的霉菌毒素污染一直是全球关注的问题。近年来由于基于核酸适配体的生物传感器具有灵敏度高、选择性好、成本低和便于携带等优点被广泛关注,目前已有部分核酸适配体检测技术成功应用于食品和饲料中霉菌毒素的检测。表5列举了基于核酸适配体的生物传感器检测AFB1、AFM1、OTA、FB1、ZEN的方法。

表5 基于适配体的生物传感器检测霉菌毒素的方法

3.1 在AFB1检测中的应用

AFB1是毒性最强的霉菌毒素之一,引起了全球食品安全领域的广泛关注。在食品和农产品检测中,时常发现AFB1的存在,尤其是在花生、玉米、饲料及谷物作物中[59]。为了使人类健康免受AFB1的危害,许多国家都制定了相关限量,如欧盟委员会规定所有谷类及谷类相关食品中AFB1含量不超过2 μg/kg[73]。为了阻止污染食品带来的食品安全恐慌和经济损失,开发出快速检测AFB1的核酸适配体传感器显得极其重要。

Chen等[74]开发了能快速、灵敏检测AFB1的荧光传感器,首先将将荧光修饰的适配体与其修饰淬灭基团的互补DNA杂交,荧光因适配体靠近淬灭基团而被淬灭;当体系中加入AFB1后,适配体与AFB1结合形成适配体/AFB1复合物导致适配体结构发生改变,从而释放cDNA,使适配体恢复荧光。通过监测荧光值的变化定量分析AFB1的浓度,在优化条件下,该方法的检测范围为5～100 ng/mL,检出限为1.6 ng/mL;该检测方法应用到不同品牌的婴幼儿配方米粉中,其回收率为93.0%～106.8%。Sun等[75]开发了基于适配体表面等离子体共振的生物传感器,可用于直接定量分析AFB1,首先将链霉亲和素固定在SPR芯片表面上,然后通过链霉亲和素与生物素之间强相互作用,捕获到生物素化的适配体;AFB1与SPR芯片上适配体的结合导致质量浓度发生变化,进而使SPR芯片上有明显反应;将适配体固定在SPR芯片表面上,监测AFB1与适配体在SPR芯片上的结合程度,可实时监测AFB1的浓度。该方法测定AFB1的浓度范围为0.4～200 nmol/L,其检出限为0.4 nmol/L。在复杂的样品基质中测定AFB1,例如稀释100倍的红葡萄酒和50倍的啤酒,其检测的回收率范围为87%～102%。该SPR传感器稳定可重复使用并有实时、灵敏度高、特异性强和高通量等优点。

Hosseini等[47]开发了一种以未修饰的金纳米颗粒(AuNPs)作为指示剂,AFB1适配体作为特异性识别元件的比色适配体传感器,在AuNPs表面上,AFB1结合适配体产生的解吸作用引起了AuNPs的聚集,使适配体与靶标相互作用,导致AuNPs的颜色从红色变成紫色。该传感器检测AFB1浓度的线性范围为80～270 nmol/L,检测限为7 nmol/L。此外,聚集的AuNPs的催化活性大大增强了化学发光反应,其中检测限为0.5 nmol/L,回归系数R2=0.9921;该方法对AFB1检测具有较高的灵敏和选择性,避免了AFB2、AFM1、AFG2、AFG1和OTA等常见霉菌毒素的干扰。Mukherjee等[48]研究了一种以基于AFB1特异性适配体与AFB1半抗原偶联物之间的荧光竞争性反应的检测方法,可用于快速、灵敏以及高通量检测AFB1,在最佳条件下,检测的线性范围为50 pg/mL～50 ng/mL,检测限为10 pg/mL;并以干红辣椒、花生和全椒为例验证该试验,在10 ng/mL和100 pg/mL水平下其回收率为92%～102%。

这些检测方法具有灵敏度高、特异性强和高通量等优点,也为之后适配体传感器发展提供了研究和探索的方向,但它们也存在一些不足,比如不能便携,不能更好地应用现场检测,对于实际样品中的AFB1的检测也不具有普遍适用性。所以为了更好的应用到实际生活中,需开发操作简单、便携、灵敏度更高的适配体传感器。

3.2 在AFM1检测中的应用

AFM1是源自肝细胞色素P450相关酶活性的AFB1羟基化代谢产物,可从摄入黄曲霉或寄生虫污染的动物性食品的家畜生产的奶或乳制品中发现[19,64]。在欧洲,牛奶中AFM1的浓度不得超过0.05 μg/kg,中国和美国规定牛奶中AFM1的浓度必须低于0.5 μg/kg[76-77]。所以开发出快速、灵敏的适配体传感器检测食品中AFM1极其重要。

Sharma等[78]利用荧光标记的AFM1适配体与TAMRA标记的互补DNA序列杂交,荧光基团和猝灭剂紧密接近导致荧光猝灭。在添加AFM1后,靶向诱导的反平行G-四链体适配体-AFM1复合物构象形成导致荧光恢复。在优化条件下,AFM1检出限为5.0 ng/kg。该检测方法已经应用于加标牛奶样品中AFM1的检测,回收率为94.40%～95.28%(n=3)。Khoshfetrat等[8]研究了一种用封闭双极电极(BPE)阵列检测AFM1的电化学发光(ECL)适配体传感器,将硫醇化的AFM1适配体固定在金纳米颗粒磁性Fe3O4纳米颗粒(Apt-GMNPs)上,之后将功能化纳米银修饰的石墨烯氧化鲁米诺(GO-L-AgNPs)通过未配对碱基的π-π相互作用连接到固定适配体(Apt-GMNPs-GO-L-AgNPs)上,将Apt-GMNPs-GO-L-AgNPs引入金阳极BPE阵列后,使各个电极经受不同浓度的AFM1,在AFM1与适配体相互作用后,GO-L-AgNPs从适配体上分离,用光电倍增管(PMT)或智能手机监测阳极中鲁米诺和H2O2的ECL,并用软件分析图像,在最佳条件下,基于PMT的BPE-ECL适配体传感器检测在5～150 ng/mL宽动态范围内呈线性关系,检测限为0.01 ng/mL;此外,基于智能手机的检测结果显示ECL图像灰度值与AFM1靶标对数浓度在10～200 ng/mL范围内呈线性关系,检出限为0.05 ng/mL。

Guo等[79]开发了一种用于检测AFM1的灵敏可靠的适配体传感器,通过生物素-链霉亲和素强相互作用使适配体在链霉抗生物素包被的PCR管表面上固定,作为PCR扩增模板的互补ssDNA与单链适配体部分杂交形成dsDNA,dsDNA在无AFM1体系下具有稳定性,在添加AFM1后,适配体和AFM1之间的结合诱导适配体构象发生变化,使互补ssDNA释放以及模板数量减少,因此,该适配体传感器可通过监测PCR扩增信号强弱变化定量测AFM1的浓度;在优化条件下,使AFM1浓度在1.0×10-4～1.0 μg/L范围内呈现线性关系,检测限低至0.03 ng/L。该方法已成功应用于婴幼儿谷物和奶粉样品中AFM1的定量测定。陈璐[25]设计了一种基于结构转换的荧光适配体传感器用于检测AFM1,用FAM修饰适配体,同时用TRAMA修饰cDNA。当体系中不存在AFM1时,适配体与cDNA杂交,由于适配体与cDNA相互靠近,导致适配体的荧光被淬灭;当体系中加入AFM1后,AFM1更易于与适配体结合,形成AFM1/aptamer复合物,导致适配体结构发生改变,从而释放cDNA;当cDNA远离适配体后,适配体荧光恢复;在最优条件下,检测到的荧光值与AFM1浓度在5～100 ng/mL之间呈线性关系,检出限为1.7 ng/mL。

这些检测方法具有操作简单、灵敏度高等优点,但不能更好应用到实际样品中AFM1的检测,特别是奶及奶制品。在未来的研究中,需要提高适配体传感器在实际样品检测中的灵敏度,解决因反应基质的不同导致适配体灵敏度降低的困难。

3.3 在OTA检测中的应用

OTA对人体和动物具有潜在致癌性,能引起免疫抑制以及免疫毒性,目前由OTA引起的食品污染现象广泛存在[38]。考虑到OTA的这些潜在毒性作用,欧盟委员会明确规定未加工谷物中OTA的最大限量为5 μg/kg,加工后的谷物为3 μg/kg,咖啡豆为10 μg/kg,葡萄酒为2 μg/mL[80]。为了避免OTA污染的风险,检测和定量食品及其原料中OTA的含量具有重要意义,所以更加灵敏、快速的检测OTA的核酸适配体传感器不断被研究出来。

Yue等[67]设计一种新型光子晶体编码悬浮阵列适配体,可同时量化和鉴定谷类样品中的OTA和FB1,将适配体通过化学键固定在光子晶体表面,当霉菌毒素出现在样品中时,适配体荧光标记的互补DNA从双链DNA杂交体中解离,导致荧光强度明显下降;该传感器以二氧化硅光子晶体微球(SPCM)的荧光强度差值定量霉菌毒素的浓度,再以SPCM的颜色或反射峰位置确定了霉菌毒素种类;该方法检测的OTA范围为0.01～1 ng/mL,检测限为0.25 pg/mL,加标谷物样品中OTA的回收率为81.80%～116.38%。Sun等[81]利用无固定化适配体-氧化石墨烯纳米片与基于DNA酶I的循环信号放大相耦合的特点,开发了一种简单可行的用于检测食品中OTA的均相电化学传感器;氧化石墨烯纳米片与核碱基和芳族化合物的非共价结合使硫堇标记的OTA适配体附着于纳米片的表面,再以带负电的丝网印刷碳电极(SPCE)获得的游离硫堇分子为电子信号;由于形成的硫蛋白适配体/石墨烯纳米复合物悬浮在检测溶液中并远离电极,从而导致电子信号变弱;当添加OTA后,分析物与适配体反应并导致硫氧还原蛋白-适配体从氧化石墨烯纳米片上解离;新形成的硫代-适配体/OTA容易被DNase I切割并释放出OTA,可重新触发硫堇-适配体/石墨烯纳米复合物,并产生大量游离硫堇分子;游离的硫堇分子被负电荷的SPCE捕获,每个分子都可以在施加电位内产生电化学信号;通过监测电流的变化,定量评估样品中OTA的浓度;在最佳条件下,该传感器检测限为5.6 pg/mL。

Samokhvalov等[82]提出了一种以适配体为受体,以锚蛋白为模板作为增强子的荧光偏振适配体传感器,这种方法利用增加结合和未结合荧光团的尺寸差异,通过荧光标记和游离的OTA与适配体之间的竞争性结合测定OTA;由于荧光标记的OTA与包含在锚定复合物中适配体的结合比与游离适配体结合产生了更高的偏振,这使得该传感器检测限降低至3.6 nmol/L,并能在15 min内完成测定;为了评估该方法对实际样品的具有适用性,在加标白葡萄酒中检出限为2.8 nmol/L,回收率为83%～113%。Modh等[83]开发了一种以适配体为辅助的基于实时PCR的靶向诱导解离方法;通过将OTA适配体固定在涂有d(T)25的磁珠(dT磁珠)上,并与适配体中OTA结合部分的互补序列用作dT磁珠和适配体序列之间的接头,将适配体固定在dT磁珠上;当添加OTA时,由于靶向诱导解离作用,使适配体从dT磁珠中释放,通过qPCR扩增定量适配体;该检测方法的浓度范围为0.039～1000 ng/mL,检测限为0.009 ng/mL。Apta-qPCR检测方法具有灵敏、稳定和选择性,可用于检测复杂样品等优点。

目前研发的用于食品中OTA检测的适配体传感器种类繁多且操作简单,并具有实际应用价值,如结合血糖仪检测食品中OTA[84]。不过主要问题仍是在改变反应基质后,传感器灵敏度降低,所以这也是今后研究的关注点之一。

3.4 在FB1检测中的应用

FB1是伏马毒素B系列中毒性最大的,可引起人体肝脏疾病和食道癌[85]。因此需要高灵敏、便捷、简单的方法用于食品中FB1的检测。Ren等[86]开发了一种一次性适配体传感器装置,将预处理的SPCE用带孔的聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜覆盖,以构建具有常规三电极的微电池,之后在工作中的电极上电沉分散良好的金纳米颗粒,作为硫醇化适配体固定的优良基质;由于单个金纳米颗粒可以装载大量对FB1特异性的硫醇化适配体,因此在SPCE上修饰AuNPs为适配体提供了丰富的结合位点,从而提供了一个3D感应界面,有效地提高了响应信号;在最佳条件下,FB1浓度与EIS信号在10 pg/mL～50 ng/mL呈现良好的线性关系,检测限为3.4 pg/mL(S/N=3)。该传感器装置具有成本低、操作简单、高灵敏度和试剂消耗少等优点。

Chen等[87]通过电化学阻抗谱开发了一种基于适配体的生物识别方法,将FB1的硫醇化适配体锚定在玻碳电极上的金纳米颗粒表面;当FB1浓度为0.1 nmol/L～100 μmol/L,FB1浓度与电阻数值呈线性关系,且检测限为2 pmol/L;该测定法可用于加标玉米样品中FB1的测定,回收率为91%～105%。桂海娈等[88]利用非标记荧光染料PicoGreen特异性识别适配体,建立了一种快速、高效检测FB1的方法,利用适配体的选择性以及PicoGreen与双链DNA结合的特异性,通过荧光信号变化确定样品中FB1浓度,实现了快速定量检测FB1的目的;整个检测流程可在40 min内完成,线性范围为0.1～1μg/L,检测限为0.1 μg/L。Yue等[67]设计了一种以适配体为基础并由光子晶体编码的悬浮阵列,可同时定量和定性检测OTA和FB1。该方法对FB1的检测范围为0.001～1 ng/mL,检测限为0.16 pg/mL,加标谷物样品中FB1的回收率为76.58%～114.79%。

这些传感器具有操作简单、灵敏度高和亲和力高等优点,其中研发的同时检测两种霉菌毒素的适配体传感器对之后同时检测多种霉菌毒素的传感器的发展提供了新的探索思路和方向。

3.5 在ZEN检测中的应用

ZEN是由镰刀菌产生的非甾体雌激素霉菌毒素,可导致DNA损伤和染色体失常,并引起牛、猪和家禽等动物的生殖问题,甚至导致人类的生殖问题[85,89]。目前检测食品中玉米赤霉烯酮的主要方法是仪器分析,该检测方法不适合现场检测,所以更需研发出高灵敏、简便和快速的方法检测食品中的ZEN。

Wu等[71]报道了一种基于上转换纳米颗粒(UCNPs)和磁性纳米粒子(MNPs)的适配体传感器,用于定量检测ZEN。将适配体及其cDNA固定在MNP和UCNP表面上来制备发光生物测定平台,然后将aptamer-MNPs和cDNA-UCNPs混合形成双链体结构。当添加ZEN,适配体从cDNA上解离并优先结合ZEN,导致发射峰的荧光强度降低。结果表明,该检测方法的检测限为0.25 μg/L,在0.05～100 μg/L范围内信号发光强度与ZEN浓度呈显著的线性相关性(R2=0.9957)。Chen等[57]开发了一种基于磁珠分离/富集的简单而快速的SELEX检测方法。将ZEN包被的磁珠与ssDNA(0～1600 nmol/L)温育60 min进行结合测定。通过热处理洗脱磁珠结合的适配体,并测量ssDNA的浓度。经过14轮SELEX,筛选出最佳适配体并成功应用于实际样品中ZEN的检测。该检测方法对ZEN的线性范围为3.14×10-9～3.14×10-5mol/L,检测限为0.785 nmol/L。

Wang等[58]通过利用单链DNA适配体和ZEN单克隆抗体(mAb-ZEN)具有高特异性和亲和性的特点,开发了一种用于检测玉米中ZEN的低氧免疫吸附测定方法。通过将纯化的mAb-ZEN作为ssDNA识别的靶标,并包被在微量滴定板上。经过15轮筛选,获得了对mAb-ZEN有最高亲和力和特异性的适配体。该检测方法的检出限为0.01 ng/mL,检测范围为0.03～2.5 ng/mL,加标样品的回收率为95%～105%。Goud等[72]开发了一种以功能性的氧化石墨烯作为FAM荧光猝灭剂为基础的适配体传感器方法。该方法测定ZEN的浓度范围为0.5～64 ng/mL,检测限为0.5 ng/mL。并成功地应用于测定加标的酒精饮料、啤酒和葡萄酒中ZEN,回收率为87%～96%,浓度范围为1～16 ng/mL。目前对于ZEN适配体传感器的研发较少,主要难题是筛选ZEN的适配体数目较少,对ZEN适配体传感器的发展具有一定的局限性。

目前研发的ZEN适配体传感器虽然灵敏度高、特异性高,但存在检测操作繁杂,操作时间长等缺点。所以ZEN适配体传感器的研究具有很大的发展空间。

4 结语与展望

近年来核酸适配体检测方法的发展证明了核酸适配体检测技术可作为取代食品中检测霉菌毒素的常规检测和分析方法,对于食品中其他小分子有害物质的检测提供了新的思路和途径。核酸适配体因具有易合成、易标记、易修饰、灵敏度高、特异性高等优点,使其在食品安全、医学检测、药物分析和疾病诊断等领域发挥着重要的作用。目前核酸适配体广泛应用于检测霉菌毒素、金属离子、微生物、蛋白质等目标物,而大多数文献报道都以AFB1、AFM1、OTA和FB1为主,其他霉菌毒素核酸适配体的文献报道几乎没有,所以筛选出其他霉菌毒素适配体及研发出相关适配体生物传感器具有一定的挑战性。

目前,已经开发出用于霉菌毒素的核酸适配体传感器包括基于比色、荧光和PCR方法的传感器[28,59,61],也存在耗时且不易执行的缺点,而且有些传感器在使用时仍需要修改仪器的检测步骤,导致操作步骤繁琐,也存在损坏仪器的可能。在检测食物样品中霉菌毒素时,检测体系中的反应基质会严重影响适配体灵敏度和准确性,特别是在测定食品中多种霉菌毒素时。通过简化的样品制备过程来降低基质效应,这也是核酸适配体检测食品中霉菌毒素面临的挑战和今后发展的趋势。尽管多数霉菌毒素核酸适配体已经得到应用,如试纸条,结合血糖仪检测等,将这些核酸适配体作为实际应用的现场检测工具仍有一定的难度,对于未来快速检测食品中霉菌毒素提供了新的思路和挑战。未来的研究可能集中研发便携、亲和力高、成本效益高的核酸适配体传感器,使这些方法更适合于现场检测。