黄浆水酯化液工艺优化及关键风味物质分析

杨铭，李亚男，陈正行*，李娟，李永富，王莉，王韧，罗小虎，李诚

1(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122) 2(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)

黄浆水是白酒固态发酵过程中沉积在窖池底部的黏稠液体，含有丰富的有机酸、酯类、醇、醛等酒类风味物质。但重铬酸盐指数(dichromate oxidizability, CODCr)较高(40 000～150 000 mg/L)，远超国家废水排放标准(1 000 mg/L，GB 8978—1996)，通常被各大酒厂降解处理后排放，潜在资源没有得到有效利用。

传统方式对黄浆水的利用主要在于将黄浆水拌糟回窑进行再次发酵或加拌优质黄泥进行养窖护窖[1]；直接把黄浆水加入蒸酒所用的锅底水中进行“串蒸”等[2-3]。这些方式改善了白酒香气，但实验结果大多流于经验。20世纪90年代开始，研究者开始着眼于酯化黄浆水中的有机酸增加香味物质，将酯化液用于“串香”，能更好地提高白酒品质[4]。21世纪开始，黄浆水逐渐用于其他新产品开发：张立强等[5]用食用酒精和黄浆水，采用液态发酵法酿制白醋；梁艳玲等[6]用树脂从黄浆水中提取乳酸；王永伟等[7]采用生物转化、多菌种协同发酵等手段制取黄浆水醋饮；唐心强等[8]利用共沸蒸馏从黄浆水中获取白酒调味品；李安军等[9]利用超临界CO2萃取技术提取黄水中的风味物质。

在所有针对黄浆水的研究中，有机酸的酯化利用一直是研究的重点。黄浆水来源于白酒，含有不可人为复制的天然香精，使它对于白酒更具价值。刘宾等[10]在黄浆水和酒尾中添加己酸和酯化酶进行正交实验，确定最优酯化条件为：乙醇含量10%、己酸添加量1.5%、酯化酶用量7%、温度30 ℃酯化7 d，在此条件下，总酯质量浓度最高可达近5 g/L。但没有对酯化时间进行单一因素实验，也没有对风味物质进行全面分析；马荣山等[11]采用化学酯化法，对黄浆水和酒尾添加正己酸和乙酸，通过提高酸度促进酯类物质的生成，在最优条件下，总酯质量浓度达到2.3 g/L较对照组1.5 g/L有所提高。但酯化效果远不如添加其他催化剂；与此类似，镇达采用732#H+交换树脂促进有机酸和乙醇的反应，在乙醇绝对超量(乙醇/黄浆水体积比为6∶4)的情况下，己酸乙酯效果最为显著，含量提高了7.5倍。

陈帅等[12]比较了1种红曲霉菌株和2种产酯酵母的酯化特性，前者较后两者酯化力更强，且酯化产物的结构轮廓与白酒类似；XIA等[13]比较了两种华根霉、一种红曲霉和一种米根霉的酶制剂对黄浆水的酯化特性，结果表明红曲酶制剂在乙醇含量10%，pH 3.5 的条件下酯化效果最好，使总酯质量浓度由4.86 g/L增加到了7.31 g/L。大量结果表明红曲在生物酯化方面具有较高的应用价值[14-17]。

纵观前人对黄浆水酯化技术的研究，采用生物技术[18]比采用化学手段有更好的效果。本实验旨在对这一结论进行验证。选取较好的催化剂进行条件优化，并对酯化前后的样品进行气-质联用分析，与洋河浓香型白酒进行比对。生物酯化法中，红曲粗酶是比较理想的酯化酶；而化学手段中不管是添加有机酸还是树脂，都是引入H+从而促进酯化反应。考虑到引入更多的有机酸违背有机酸回收利用的初衷，而酒尾中含有更多的杂环醇会降低产品品质，因此选取富含红曲粗酶的红曲粉和H+交换树脂为催化剂，对黄浆水和乙醇(不添加酒尾)进行酯化实验。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄浆水：江苏洋河酒厂(浓香型)，已预先经过离心处理去掉大部分固形物；52°天之蓝白酒：江苏洋河酒厂；红曲粉：武汉佳成生物制品有限公司，酒用酯化红曲粉，平均酯化力(46±5) mg/(g·100h)；732# H+交换树脂：国药沪试化学试剂有限公司；无水乙醇：分析纯，国药沃凯；2-辛醇、乙酸香叶酯、特戊酸、2-乙基己醇:色谱纯，Sigma公司。

1.2 仪器与设备

50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头,美国Supelco公司；SCION SQ-456-GC气-质联用仪,美国布鲁克公司；DB-Wax 60 m×0.25 mm×0. 25 μm气相色谱柱，美国Agilent公司；超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 酯化试验方法

取200 mL黄浆水于500 mL锥形瓶中，分别加入无水乙醇(0、10、20、30、40 mL)，红曲粉(0、5、10、15、20、25 g)或H+交换树脂(0、2.5、5、7.5、10、12.5 g)，气浴摇床振荡30 min后放入恒温培养箱(25、31、37 ℃) 酯化一定的天数(7、14、21、28、35 d)，对酯化液的总酯含量进行测定。

分别设定无水乙醇30 mL，红曲粉 20 g，酯化温度31 ℃，酯化时间14 d为固定因素，进行单一因素实验。

1.4 总酸、总酯测定

结合文献[19]与《GBT 10345—2007 白酒分析方法》改进总酸总酯的测定方法如下(联合滴定-电位法)：

待测液制备:准确量取黄浆水试样5.00 mL(准确至 0.01 mL)，用去离子水稀释并定容至250 mL，摇匀备用。

转移待测液50 mL到250 mL圆底烧瓶中，加入搅拌子，插入pH计电极，以NaOH标准滴定液滴至pH=8.2。上述溶液准确加入NaOH标准滴定液25 mL (若总酯较高，可加入50 mL)，放入玻璃珠，装上冷凝管，于沸水浴上加热回流30 min。取下冷却后以H2SO4标准滴定液滴至pH=9.0，减慢滴定速度，每次半滴，直至pH=8.7。同时吸取乙醇(无酯)溶液50 mL，按上述方法做空白对照试验所得结果均保留至两位小数。

实验结果按公式(1)计算：

(1)

式中:X1，总酸，以己酸计，g/L；c，NaOH标准滴定液浓度，mol/L；V1，消耗NaOH标准滴定溶液的体积，mL；5，稀释倍数；5.00，量取黄浆水的体积，mL； 116.16，己酸摩尔质量，g/mol。

(2)

式中:X2，总酯，以己酸乙酯计，g/L；c，H2SO4标准滴定溶液的浓度，mol/L；V0，空白试样消耗H2SO4标准滴定溶液的体积，mL；V2，样品消耗H2SO4标准滴定溶液的体积，mL；5，稀释倍数；5.00，量取黄浆水的体积,mL；144.21，己酸乙酯摩尔质量，g/mol；

1.5 顶空-固相微萃取和GC-MS方法

顶空-固相微萃取方法：在20 mL顶空瓶中加入8 mL待测酯化液或稀释10倍的天之蓝白酒，3 g NaCl，20 μL内标溶液(mg/L): 2-辛醇41.00，乙酸香叶酯45.89，特戊酸44.34，2-乙基己醇41.55(以上均为最终浓度)，50 ℃预热5 min，以固相微萃取头进行吸附萃取，保温30 min，进GC-MS进行分析，解吸5 min。

GC-MS方法：使用DB-Wax毛细管色谱柱对样品进行分离。GC升温程序：50 ℃保持2 min，以5 ℃/min 的速度升温至90 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min 的速度升温至230 ℃,保持7 min；进样口温度 250 ℃，载气He，流速2 mL/min，进样量1 μL，不分流进样。MS条件：EI，电离能量 70 eV，灯丝电流设定值 120 μA；离子源温度200 ℃。扫描方式：Scan，扫描范围50～550 u。

2 结果与分析

2.1 黄浆水理化成分分析和主要风味化合物

不同产地、不同香型、不同酒厂所产生的黄浆水理化成分差异极大，该文对洋河酒厂所提供的黄浆水原料进行了基础的理化检测，结果如表1。洋河浓香型黄浆水pH值为2～4，符合黄浆水的一般特性；其蛋白质和总酯质量浓度较低，而总酸质量浓度高达52～56 g/L，较同类样品稍高；此外，黄浆水中总糖质量浓度较高，这是造成样品黏度较高的主要原因。含量丰富的有机酸为我们酯化黄浆水以提高总酯水平提供了前提。

表1 洋河浓香型黄浆水基本理化性质Table 1 Basic physical and chemical properties of Yanghe yellow water

注：表中“%”均表示质量分数。

由表2可知，洋河浓香型白酒黄浆水中的挥发性成分主要为有机酸，其浓度远远高于醇、醛、酯等其他成分。

表2 洋河酒黄浆水风味化合物质量浓度Table 2 Concentration of flavor compound in Yanghe yellow water

续表2

化合物 质量浓度/(mg·L-1)有机酸己酸3 942.11辛酸1 520.03丁酸1 206.26庚酸628.64丙二酸530.17乙酸266.69正戊酸155.95二甲基丙二酸46.545-甲基己酸33.132-甲基丁酸30.40丙酸24.68异己酸23.84甲酸5.48有机酸总计8 413.92醇类化合物正己醇0.596异戊醇0.398苯乙醇0.187丁醇0.099正辛醇0.084正庚醇0.055桉叶油醇0.0282-庚醇0.0271-戊醇0.025异丁醇0.0222-戊醇0.0151-壬醇0.010合金欢醇0.0062-戊醇0.006醇类总计1.730醛类乙醛0.0662-甲基丁醛0.0233-甲基丁醛0.133糠醛0.446苯甲醛0.1902,4-二甲基苯甲醛0.036醛类总计0.895酚类2,4-二叔丁基苯酚0.8804-甲基愈创木酚0.331邻甲酚0.3024-乙基-2-甲氧基苯酚0.103对乙基苯酚0.0712,6-二叔丁基-4-乙基苯酚0.008酚类总计1.695

有机酸主要以己酸质量浓度最高，乙酯化产物己酸乙酯恰恰与浓香型白酒的特征风味物质相符。含量其次高的有机酸为丁酸，接下来是一些长链有机酸，如戊酸、庚酸、辛酸等，其相应的酯化物：丁酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯皆是洋河绵柔型白酒的重要风味成分；除了有机酸类，黄浆水中还含有与浓香型白酒风味息息相关的酯类物质。这些酯类物质种类丰富、浓度较低，含量最高的己酸乙酯，其质量浓度也仅仅只有4.141 mg/L。黄浆水中的酯类物质主要是乙酯类，除此之外还有少量甲酯、丙酯等。黄浆水中2-甲基丁酸的质量浓度为30.40 mg/L，其相应的乙酯化物2-甲基丁酸乙酯是洋河天之蓝白酒除己酸乙酯外较重要风味物质。由于该酯化物阈值很低(0.2 μg/L)，所以少量即产生明显风味。

2.2 黄浆水酯化单一因素实验

羧酸跟醇的反应是可逆的，一般情况下反应极其缓慢，达到平衡的时间也较为漫长。此反应是SN2反应，即两反应物分子先结合，再进行化学键的断裂，脱去杂原子基团。如图1，羧酸上的羰基碳在质子酸的作用下更易缺电子，从而被亲核试剂醇攻击，两者加合形成新的离子基团；新的离子基团脱去水，从而形成酯。当质子酸不存在时，羧酸和醇很难发生加成反应，因此步骤②是酯化反应的控制步骤；而步骤④是逆反应水解反应的控制步骤。通过此反应机理可知，提高酯得率的关键在于提供质子酸H+和脱去反应产物H2O。

图1 酯化反应机理Fig.1 Esterification mechanism

浓H2SO4兼具提供质子酸H+和脱去反应产物H2O两种作用，因此通常被用作工业生产酯类物质的催化剂。

但黄浆水体系中80%以上都是水，加入浓H2SO4不仅成本大而且难度高；且浓H2SO4作为高危化工产品，按照规定不允许在食品体系添加。考虑到食品安全性和产品认可度，应尽量选取安全可靠的催化剂。

2.2.1 催化剂的种类和添加量对酯化反应的影响

红曲酯化酶是天然酯化剂，红曲则是天然红色素，长期应用于餐饮行业和食品加工业中(玫瑰烧肉、豆腐乳)，更具有健脾消食，活血化瘀的保健功效。张丹等[2]将红曲霉菌和酵母菌混合培养制成生物制剂用于黄浆水酯化，使得黄浆水中的主要风味酯类均有大幅上升；张立强等[20]探究了麸皮红曲的培养方法及最佳酯化条件，并表明在麸皮中加入黄水可以有效地提高麸皮红曲的酯化力；陈帅等[21]基于响应面优化了红曲酶促酯化黄浆水的条件，最佳条件下总酯提高了8倍以上。为了验证生物法和无机法对黄浆水中有机酸的酯化效果，我们分别采用酒用酯化红曲粉和H+交换树脂作为催化剂，对黄浆水/乙醇混合液进行了单一因素实验。

图2表示红曲粉加入5 g时，总酯质量浓度由1.6 g/L快速增加至3.9 g/L；加入5～15 g的红曲粉，总酯含量增加的幅度变小；进一步添加红曲粉，总酯增加的趋势减缓，已经没有显著差异。实验表明，红曲粉添加至20 g既可满足酯化反应对催化剂的需求，该实验条件下，总酯质量浓度提高至5.5 g/L。

图2 红曲添加量对酯化液总酯的影响Fig.2 Effect of Monascus powder addition on total ester concentration注：图中不同小写字母表示差异显著。下同。

图3表明加入H+交换树脂能够一定程度上促进酯化反应，加入2.5 g树脂时总酯质量浓度提高到近4 g/L。 但继续添加树脂并不能进一步促进酯化，加入7.5 g乃至更多的树脂反而使总酯有轻微的下降趋势。H+交换树脂的加入提供了质子酸，在一定程度上促进了酯化反应正向进行，但树脂并不是越多越好。综上所述，红曲粉酯化力优于H+交换树脂，因此选择红曲粉作为催化剂。

图3 氢离子交换树脂对酯化液总酯的影响Fig.3 Effect of ion exchange resin on total ester concentration

2.2.2 乙醇添加量对酯化反应的影响

乙醇添加量对酯化液总酯的影响如图4所示。随着乙醇浓度的提升，总酯质量浓度不断增加，添加量达到30 mL 后，过量的乙醇无法促进产生更多的酯类。乙醇是酯化反应的底物，其浓度高低直接影响正向反应速率。适量的乙醇对反应有促进作用，但是过多的乙醇不仅会使红曲粉中的酯化酶变性失活，而且会冲淡黄浆水中有机酸浓度，减慢反应速率。从图中可以看出，乙醇添加量在30 mL时达到临界值，再增加浓度无法提高总酯质量浓度，反而会阻碍反应的进行。

图4 乙醇添加量对酯化液总酯的影响Fig.4 Effect of the amount of added ethanol on the total ester concentration

2.2.3 反应时间对酯化反应的影响

图5反映了总酯和酯化时间的关系，结果表明，随着酯化反应的进行总酯质量浓度不断升高，酯化4周后，总酯含量增长缓慢，继续延长酯化时间，总酯质量浓度增加没有显著性差异。实验进一步表明，黄浆水体系中的酯化反应是缓慢的可逆反应，在酯化阶段后期反应逐渐趋于平衡。为了节省时间成本、取得最大收益，选取酯化时间28 d较为适宜。

图5 反应时间对酯化液总酯的影响Fig.5 Effect of reaction time on total ester concentration

2.2.4 反应温度对酯化反应的影响

红曲活性最佳温度为30～32 ℃，在(31±6)℃进行酯化试验，如图6所示。

图6 反应温度对酯化液总酯的影响Fig.6 Effect of the amount of added ethanol on the total ester concentration

当酯化温度为31 ℃时，总酯质量浓度达到最高，故选取酯化温度为31 ℃。

使用SPSS对以上4因素进行方差分析，红曲粉添加量、乙醇添加量、反应时间这3个因子对总酯都有非常显著的影响(**,P<0.01)，而反应温度对总酯具有显著影响(*，0.01

2.3 黄浆水酯化正交实验

表3是4因素混合水平正交表，表4是正交实验方案和16组实验数据，并对其进行了直观分析。

表3 正交实验因素水平表Table 3 Orthogonal test design table

表4 正交试验方案及实验结果分析Table 4 The results of orthogonal test and data analysis

在A、B、C、D4个因素中，极差R最大的是C列，即酯化时间。这说明该酯化时间的改变对实验结果的影响最大，是最主要的因素。其次主要的因素依次是乙醇含量、反应温度和红曲粉含量。空列的极差值最小但接近A列的极差值，这说明上述各因素之间存在的交互作用并不显著。表4表明，在试验范围内最佳的试验方案为A3B3C4D2即：红曲粉 20 g (8% 质量分数)、乙醇 30 mL (13%体积分数)、酯化时间 35 d、反应温度31 ℃。

结合2.2.3以时间为单一变量的试验结果，在其他条件一致的状况下，最佳方案A3B3C4D2和方案A3B3C3D2的总酯质量浓度没有显著性差异。考虑到时间成本，应选择方案A3B3C3D2即：红曲粉 20 g (8%质量分数)、乙醇 30 mL (13%体积分数)、酯化时间28 d、反应温度31 ℃为最优工艺。

2.4 风味成分分析及与香气轮廓对比

对优选方案(红曲粉20 g、乙醇30 mL、酯化时间28 d、反应温度31 ℃)酯化液及洋河天之蓝白酒的风味物质进行定性及定量分析，风味化合物的阈值和质量浓度列于表5和表6。

表5 天之蓝白酒主要风味物质阈值及香气特征Table 5 The threshold and aroma characteristics of main flavor substances in Tianzhilan liquor

对比表2和表5可知，己酸乙酯质量浓度由酯化前的4.14 mg/L增加到220.64 mg/L；丁酸乙酯由0.532 mg/L 增长到17.39 mg/L；戊酸乙酯由0.438 mg/L增长到4.76 mg/L；2-甲基丁酸乙酯由0.003 mg/L增长到0.31 mg/L；仪器可检出的总酯由8.30 mg/L增长到428.4 mg/L。酯化后主要风味酯类全部提高了10倍以上。有机酸的浓度有所减少，但依旧保持较高水平。

表6 酯化液风味化合物质量浓度Table 6 Concentration of flavor compound in esterification liquid of yellow water

续表6

化合物 质量浓度/(mg·L-1)异戊醇0.19醇类总计112 378.1醛类异戊醛1.430壬醛0.183辛醛0.046癸醛0.033己醛0.011壬烯醛0.006醛类总计1.708酚类2,4-二叔丁基苯酚0.1204-甲基苯酚1.1654-乙基-2-甲氧基苯酚0.200苯酚0.3362,6-二叔丁基对甲酚1.0984-甲基愈创木酚0.331酚类总计3.025

图7和图8反映酯化液和天之蓝白酒中的风味成分有诸多相似之处。

图7 酯化液挥发性成分总离子流图Fig.7 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in the esterified liquor

图8 洋河天之蓝白酒(10倍稀释)挥发性成分总离子流图Fig.8 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in the Yanghe Tianzhilan liquor (10 times dilution)

白酒中可检出的风味成分在酯化液图谱相应位置均有出峰。白酒中最显著的风味成分是己酸乙酯，该化合物同时是酯化液中含量最多的风味酯类。其他对白酒风味有较大贡献的酯类如：乙酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯等在酯化液中均有检出，且峰面积的相对大小与白酒较为相似；有机酸方面，酯化液中的己酸含量依然有较高水平，其次是辛酸、庚酸和丁酸，相对大小与洋河天之蓝白酒相一致。

由表6和表7可知，酯化液中酯类物质种类与白酒重合度较高，与上述结论一致。

表7 天之蓝白酒风味化合物质量浓度Table 7 Concentration of flavor compound in Tianzhilan liquor

续表7

化合物 质量浓度/(mg·L-1)正戊酸4.71丁酸4.27乙酰丙酸4.17有机酸总计1 593.17醛酮类乙醛4.122-甲基丁醛1.10异戊醛4.99己醛2.85壬醛0.77苯甲醛9.862,4-二甲基苯甲醛2.964-甲基-2-己酮0.811-壬酮1.08苯乙酮1.08苯乙酮1.08醛酮类总计29.63醇类2-丁醇0.431-丙醇1.32异丁醇1.083-甲基-2-丁醇0.46丁醇1.98异戊醇10.12正己醇11.032-乙基-4-甲基戊醇0.31辛醇0.21正辛醇0.89醇类总计29.30

但各酯类化合物质量浓度较白酒普遍偏低，这与酯化液中含水量仍旧较高有关，后续应用应对酯化液进行除水和浓缩。酯化液中己酸浓度是白酒中的2倍，这较黄浆水中的己酸已经大大减少，酯化液中的其他有机酸类也较白酒稍高。

由于各风味化合物的香气阈值不同，因此仅通过质量浓度不能反映香气轮廓[22]。综合各方面对浓香型白酒的研究[23-26]，挑选出对酒体香气贡献较大的16种主要风味物质，它们的阈值及香气特征罗列在表5中。

图9反映的是16种主要风味物质香气活力值(OAV，质量浓度与阈值之比[27])的对数雷达图[13]，其中低于0的数值代表该化合物浓度低于人体感官阈值。从图中可以看出，黄浆水、酯化液和白酒在有机酸产生的风味上轮廓较为相近，这是由于各类有机酸的阈值普遍较大。三者的主要差别在酯类风味一侧，酯化液和白酒的轮廓较为接近，但面积小于白酒；黄浆水在酯类一侧的轮廓面积远远小于两者。这说明酯化对黄浆水的香气轮廓产生了显著的影响，为黄浆水在白酒中的应用增加了有益风味成分。

图9 主要风味物质OAV对数雷达图Fig.9 OAV logarithmic radar chart of main flavor substances

3 结论

通过对黄浆水进行理化分析和风味物质定量检测，进一步确定了黄浆水的潜在利用价值和酯化提高重要风味物质的可行性。通过单一因素实验明确了催化剂用量、乙醇添加量、酯化时间、酯化温度对于酯化反应的影响规律，并通过正交实验确定了洋河酒黄浆水的推荐酯化条件为：红曲粉8% (质量分数)、乙醇 13% (体积分数)、酯化时间 28 d、反应温度31 ℃。最后对酯化液进行GC-MS分析，发现酯化后关键风味物质酯类的浓度提高了10倍以上，风味物质种类丰富能与目标白酒相符，但总体酯化率还有待提升。另外，寻找更好地缩短酯化周期的且兼顾食品安全性的高效催化剂，也是后续研究的重点之一。