天然发酵产物γ-聚谷氨酸修饰金纳米星及其pH响应性

关桦楠，龚德状，宋岩，韩博林，梁金钟，王薇，宇佳

1(哈尔滨商业大学 食品工程学院，黑龙江 哈尔滨，150076) 2(东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨，150040)

以金纳米粒子为代表的贵金属纳米材料因其具有良好的生物相容性、较大的比表面积和活跃的光电化学性质，已被广泛应用于生物分析检测领域[1-4]。金纳米粒子具有典型的表面等离子体共振特性，且不同形态的金纳米粒子(颗粒状、棒状、线状和星状)具有不同的共振特性[5-7]，这使其具有特定的尺寸效应，即当粒子间隙大于平均粒径时，整个体系呈现出肉眼可见的酒红色，而当粒子间隙小于平均粒径时，体系颜色由酒红色向蓝紫色转变[8-11]。根据这一特性，可以通过金纳米粒子体系颜色的变化来判断粒子间的分散和团聚。聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，PGA)具有良好的生物相容性、生物可降解性和水溶性等特性，是医药、食品、水处理、农业等行业的研究热点[12-16]。利用微生物天然发酵产物聚合制备γ-PGA，原料易得且可循环再生，符合可持续发展的观点，具有很好的经济价值和应用前景[17-19]。本实验选取CTAB还原法制备出星状金纳米粒子，且表面带有正电荷；选择表面带有负电荷的聚谷氨酸，依靠静电吸附作用，修饰在金纳米星的表面；利用聚谷氨酸在不同pH条件下，因其氨基酸结构发生变化所造成的金纳米星发生自组装-去自组装的变化，进而来考察聚谷氨酸修饰金纳米星(poly-γ-glutamic acid-stabilized gold nanoparticles, PGA-AuNPs)在不同的酸碱度条件下的响应情况。本实验将为食品工业生产、医药研发和环境保护等领域开发新型pH敏感响应材料提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

用于发酵生产聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，由哈尔滨商业大学食品工程学院发酵工程实验室改良提供；氯金酸、K2CO3、AgNO3和抗坏血酸，均购自国药集团化学试剂有限公司；十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)和硼氢化钠，购自上海振兴化工一厂；本实验所用试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

2000 EX透射电子显微镜，日本JEOL公司；UV2250紫外-可见光分光光度计，北京桑翌科技发展有限公司；F2500型荧光分光光度计，日本日立公司；MAGNA-IR560E.S.P型傅里叶变换红外光谱仪，美国Nicolet公司；BT-9300H激光粒度分布仪，中国昆山广测仪器设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 星状金纳米粒子的制备与表征

在20 mL锥形瓶中依次加入10 mL的去离子水，5 mL 的CTAB溶液(0.2 mol/L)，2 mL的氯金酸溶液(10 g/L)。搅拌均匀后，快速加入0.6 mL的硼氢化钠溶液(0.01 mol/L)持续温和搅拌，当目测反应体系颜色加深时，停止搅拌，于室温条件下，静置2 h后备用，此为金种液。

将19 mL的CTAB水溶液(0.2 mol/L)与1 mL的氯金酸溶液(10 g/L)充分混合，再加入0.2 mL的AgNO3溶液(0.01 mol/L)，搅拌均匀后，加入0.2 mL抗坏血酸溶液(0.1 mol/L)，将0.2 mL金种液加入到反应体系中，静置过夜，离心取沉淀，所得即为星状金纳米粒子。采用透射电子显微镜观察金纳米粒子的表观形貌；采用紫外-可见光分光光度计测定金纳米粒子的特征吸收峰。采用激光粒度分布仪测定金纳米粒子的粒径分布。

1.3.2 聚谷氨酸的发酵制备

在37 ℃条件下活化枯草芽孢杆菌种子液，振荡培养 18 h(150 r/min)。将活化后种子液接种于发酵培养液中(接种量为3%)，随后继续在37 ℃条件下振荡培养 72 h。将发酵液离心去沉淀(4 000 r/min，30 min)，向上清液中加入无水乙醇(1∶2，体积比)，剧烈振荡后得到絮状沉淀物，离心取沉淀(4 000 r/min，30 min)， 用无水乙醇水溶液清洗2遍，置于真空干燥箱中下烘干备用，此为PGA固体粉末。

1.3.3 聚谷氨酸修饰金纳米粒子的制备与表征

向20 mL所制备的金纳米星体系中加入质量浓度为10 mg/L的聚谷氨酸胶体溶液5 mL，室温条件下温和搅拌3 h(50 r/min)，然后离心去除上清液(4 000 r/min)，采用去离子水清洗沉淀2次，用以去除多余的聚谷氨酸胶体，真空干燥后所得固体即为聚谷氨酸修饰的金纳米星(PGA-AuNPs)，采用去离子水稀释备用，4 ℃条件下贮存。采用紫外-可见分光光度计测定PGA-AuNPs特征吸收峰。采用傅里叶变换红外光谱仪对PGA-AuNPs表面基团结构进行分析。

1.3.4 不同pH条件下PGA-AuNPs的比色传感

取2 mL PGA-AuNPs胶体(20 g/L)置于10 mL的离心管中，添加2 mL去离子水，再采用NaOH或HCl调节体系pH，总体系计为8 mL，采用去离子水补齐体系。充分混匀后，静置10 min，观察整个体系颜色的变化。

1.3.5 不同pH条件下PGA-AuNPs的荧光强度变化

取2 mL PGA-AuNPs胶体(20 g/L)置于10 mL的离心管中，添加2 mL去离子水，再采用NaOH或HCl调节体系pH，总体系计为8 mL，采用去离子水补齐体系。充分混匀后，静置10 min，待颜色稳定后，于3 mL 具塞比色皿中，准确加入2.5 mL的该体系溶液，在荧光分光光度计上，设激发和发射光谱通带为5.0 nm，以λex=λem方式进行同步扫描，并在波长430 nm处测定体系的荧光强度。

2 结果与分析

2.1 星状金纳米粒子的表征

本实验拟采用静电吸附法，将带有负电荷的聚谷氨酸修饰于所制备的金纳米粒子表面，因此需要制备出表面带有正电荷的金纳米粒子。利用晶种生长法，以CTAB作为还原剂和保护剂制备带有正电荷的星状金纳米粒子。由图1可知，采用晶种生长法所制备的金纳米粒子在紫外-可见光光谱中，于波长527 nm处具有明显的特征吸收峰，此为金纳米粒子的表面等离子共振吸收峰，初步判定所制备的粒子为金纳米星。

图1 CTAB法制备的金纳米星的紫外-可见光吸收光谱Fig.1 UV-VIS spectra of star likegold nanoparticles were prepared by CTAB method

采用透射电子扫描电镜对所制备的金纳米星的表观形貌进行表征。由图2可知，CTAB晶种生长法所制得的金纳米粒子并非是圆球形，而是呈现五角星状，且分布较为均匀，没有出现明显的团聚的现象，目测粒径大小 20～30 nm。

A-放大6 000倍；B-放大8 000倍图2 CTAB法制备的金纳米粒子的透射电子显微镜图片Fig.2 TEM images of gold nanoparticles were prepared by CTAB method

至于金纳米星的形成，是因为在CTAB还原而成的晶种生长过程中，不同剂量的CTAB和AgNO3会改变晶种生长的方向，以放射状的形式累积，进而生长为星状结构。采用激光粒度分布仪测定金纳米星的平均粒径为(28.93±8.96) nm，采用电位仪测得金纳米星表面电势为21 mV，说明其表面带有正电荷。

2.2 PGA-AuNPs的制备与表征

由于金纳米粒子与聚谷氨酸之间的静电引力，当提高聚谷氨酸的浓度并在加入的同时快速搅拌金纳米星溶胶与聚谷氨酸的混合液时，金纳米星表面的会被聚谷氨酸酸所取代，从而使金纳米星表面的电荷发生偏转，并稳定存在于溶液中[20-22]。聚谷氨酸修饰前后的金纳米星紫外-可见光光谱如图3所示。由图可知，聚谷氨酸修饰后金纳米星的吸收峰发生红移。一般研究认为，随着金纳米粒子的粒径增大，其紫外-可见吸收光谱峰展宽且向长波方向移动，该结果说明聚谷氨酸的修饰造成了金纳米粒子粒径的增大[21]，从一定意义上来讲，聚谷氨酸已成功包覆在了金纳米粒子的表面。

图3 聚谷氨酸修饰前后紫外-可见光吸收光谱Fig.3 UV-VIS spectra of poly glutamic acid before and after modification

为进一步确定聚谷氨酸是否修饰在金纳米星的表面，采用红外光谱表征其表面基团结构。由图4可知，在PGA-AuNPs的红外光谱中，分别在1 657和 1 597 cm-1处具有酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ特征峰。同时在1 628 和1 423 cm-1出现两个峰，分别归属于-NH3+变形振动峰和-COO-对称伸缩振动吸收峰，在1 022.94 cm-1处有C-O伸展峰得到加强，说明通过静电作用PGA已成功修饰于金纳米星的表面[21，23-25]。

图4 PGA-AuNPs的傅立叶红外光谱图Fig.4 FTIR spectra of PGA-AuNPs

2.3 PGA-Au的pH响应性研究

一般研究认为，枯草芽孢杆菌的天然发酵产物γ-聚谷氨酸的等电点PI在4～5。而此类聚谷氨酸的结构对体系中的pH十分敏感。当体系中的pH高于等电点时，聚谷氨酸的二级结构会发生随即卷曲[26-27]；而当体系中的pH低于等电点时，结构开始逐渐转变为ɑ-螺旋[27]。在结构转变的过程中，聚谷氨酸表面的电荷会发生反转，导致具有不同电荷的聚谷氨酸产生静电吸附，彼此聚集，正是根据此原理选择聚谷氨酸修饰金纳米粒子。不同的pH值能够诱导聚谷氨酸的结构发生变化，进而引起金纳米粒子的组装和去组装，整个过程可以通过金纳米星的颜色变化显示出来，从而可以实现其对pH敏感响应的目标。设置pH值为1～12，加入PGA-Au纳米粒子，反应一段时间后，观察颜色变化，见图5。

图5 PGA-AuNPs的pH响应比色研究Fig.5 Study on pH response colorimetric of PGA-Au

由图5可知，pH值为4时，为PGA-AuNPs的初始颜色，加入体系中后颜色几乎没有发生变化；pH值为3时，体系为酒红色，粒径相比于pH为4的体系时稍有减小，说明当pH低于等电点时，聚谷氨酸与金粒子解体，使得粒径减小；当pH值为1和2时，解离后的金纳米星在聚谷氨酸的作用下迅速聚集，因此比色反应体系为灰色；当pH值为5～11时，颜色逐渐由淡紫色变为紫色，说明pH高于等电点后，开始改变聚谷氨酸的结构，使得金纳米粒子开始缓慢聚集；当pH值为12时，体系变为蓝灰色，粒子大量聚集成团，形成沉淀。

一般研究表明，金纳米粒子聚集后会使得表面等离子体共振散射强度衰弱，进而引起荧光强度的减弱[21]。实验中采用荧光光谱评估金纳米星在不同pH条件下的荧光强度变化，结果见图6。

图6 PGA-Au的pH响应体系的荧光光谱图Fig.6 Fluorescence spectra of PGA-Au pH response system

由图可知，当pH值为4时，PGA-AuNPs具有最强的荧光强度，伴随pH的变化，PGA-AuNPs的荧光强度逐渐发生衰退，其荧光强度的分布规律与比色体系中的基本一致。

3 结论

本研究采用CTAB法成功制备出表面带正电荷的星状金纳米粒子，并利用天然发酵产物聚谷氨酸修饰金纳米星，构架出对pH敏感的新型纳米材料。研究结果表明所制备的金纳米星粒径分布均匀，针对不同的pH会产生规律的变色，同时也会造成体系荧光强度的变化。根据此结果，可以使得所制备的pH敏感金纳米星，应用于诸多领域。本实验将为开发新型pH敏感材料提供基本材料，为食品工业和医药工业的发展积累基础数据。