不同发酵工艺对资丘木瓜酵素品质的影响

梅子龙，陈润杰，王 旺，陈 欢，胡 娅，许鹏飞，吕育财，2，龚大春，2

（1.三峡大学湖北省生物酵素工程技术研究中心，湖北宜昌 443002；2.三峡大学生物催化重点实验室，湖北宜昌 443002）

生物酵素产业是一个朝阳产业，归属于我国生物产业和健康产业，是农业、工业和服务业三产业融合的大产业。随着我国老龄化社会的到来和生活方式的加快，我国人口的75%处于亚健康状态，慢病防控迫在眉睫，酵素产品将在提升健康品质、改善亚健康方面发挥重要作用[1]。目前，我国植物食用酵素工艺比较单一，大都以自然发酵为主，产品品质不易控制[2]。李建强等人[3]以单一水果和植物综合果蔬分别为原料，研究了自然发酵和植入微生物三级发酵2种工艺对酵素产品超氧化物歧化酶（S OD）活性的变化。结果表明，在发酵过程中植入酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物菌，对酵素S OD活性有明显的提高作用。

我国木瓜酵素产品研究开发才刚刚起步，目前以传统食用木瓜为原料制备酵素的专利报道只有3项[4-6]，主要以黑曲霉、乳酸菌、酵母菌等为发酵菌株，采用一次混合，所制备的木瓜酵素具有降血糖、促进消化等功效，但以资丘木瓜为原料制备酵素的方法尚不多见。目前，三峡大学叶汪阳和贺海波等人[7-8]最早对资丘木瓜开展研究，利用硫磺菌接种制备的皱皮木瓜果酵素有较好的降血脂和减肥作用，并采用蜂蜜改进了资丘木瓜味酸、涩、硬等感官品质的不足。

资丘木瓜是三峡地区特色种植的药食两用植物，长阳土家族自治县榔坪镇每年大约种植4 000 km2，加工方式简单，除了鲜销和饮片2种半成品出售方式外，还未进入大健康产业，极大地制约了资丘木瓜种植业的发展。因此，试验以长阳资丘木瓜为原料，研究3种不同发酵工艺对木瓜酵素品质的影响，将对延长木瓜产业链、推动木瓜种植业的健康发展具有重要意义（目前该方面研究在国内尚未见文献报道）。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株与试剂

资丘木瓜（Chaenomelesspeciosa（Sweet）Nakai），长双歧杆菌（Bifidobacterium longum），嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus），酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus） 等，均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC（China Center of Industrial Culture Collection）。

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司提供；蔗糖、乳糖、木糖，天津市科密欧化学试剂有限公司提供；所有化学试剂均为分析纯。

1.1.2 培养基

（1） 种子培养基成分。蔗糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L。

（2） 斜面保藏培养基。蔗糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，琼脂20 g/L。

1.1.3 主要仪器

自制1 L酵素发酵罐、5 L三联式发酵罐；30 L全自动灭菌发酵罐，德国贝朗公司产品；D HG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技公司产品；SX-700型灭菌锅、M X-307型冷冻离心机，上海天美公司产品；U V-1800型分光光度计，日本岛津公司产品；LC5090型高效液相，浙江福立公司产品等。

1.2 试验方法

1.2.1 3种发酵方式及主要流程

以资丘木瓜为主要原料，分别采用自然发酵（1号罐）、酵母菌-德氏乳杆菌保加利亚亚种-嗜热链球菌先后顺序接种发酵（2号罐）、酵母菌-长双歧杆菌-嗜热链球菌先后顺序接种发酵（3号罐）3种工艺制备木瓜酵素，总时间为100 d。具体流程如下:

（1） 1号自然发酵（1号罐）。木瓜原料→清洗、消毒→晾干、切片→装桶、压紧→加白砂糖→常温发酵（60 d）→酵素→过滤→装瓶→成品。

（2） 2号接种发酵（2号罐）。木瓜原料→清洗、消毒→晾干、切片→装桶、压紧→加白砂糖→植入酵母菌→常温发酵（30 d）→植入德氏乳杆菌保加利亚亚种→45℃下发酵（30 d） →植入嗜热链球菌→47℃下发酵（40 d）→酵素→过滤→装瓶→成品。

（3）3号接种发酵（3号罐）。木瓜原料→清洗、消毒→晾干→装桶、压紧→加白砂糖→植入酵母菌→常温发酵（30 d）→植入长双歧杆菌→40℃下发酵（30 d） →植入嗜热链球菌→47℃下发酵（40 d）→酵素→过滤→装瓶→成品。

1.2.2 木瓜酵素DPP H·的清除作用[7]

在发酵过程中进行定期取样，发酵液以转速8 000 r/min离心后，取上清液用于测定。

准确称取20 mg DPP H·，用无水乙醇定容于250 mL容量瓶中，得到质量浓度为80μg/mL的DPP H·溶液，将酵素样品用离心除去固体物质。取1 mL测试液及1 mL的质量浓度为80μg/mL DPP H·混匀后避光反应30 min，定容至5 mL。于波长517 nm处测定吸光度的变化，对照溶剂用无水乙醇代替，DPP H·清除率的计算公式:

式中:A1——1 mL DPP H·液与1 mL提取液的吸光度；

A2——1 mL提取液与1 mL无水乙醇的吸光度；

A3——1 mL DPP H·液与1 mL无水乙醇的吸光度。

1.2.3 木瓜酵素清除O2-·能力的测定[8]

取pH值8.2的Tris-HCL缓冲液4.5 mL，分别加入4.2 mL蒸馏水和浓度为25 mmol/L邻苯三酚0.3 mL，混匀后于25℃条件下反应5 min，立即加入1 mL浓度为8 mol/L的HCl溶液，终止反应，定容至25 mL。于波长299 nm处测定吸光度，测得A1；另取缓冲液4.5 mL，蒸馏水定容至25 mL，于波长299 nm处测定吸光度，测得A2；另取缓冲液4.5 mL，加入酵素测试液1 mL，蒸馏水3.2 mL，邻苯三酚溶液0.3 mL，混匀后于25℃条件下反应5 min，立即加入1 mL浓度为8 mol/L的HCL溶液，终止反应，定容至25 mL。于波长299 nm处测定吸光度，测得A3。同上步操作，但是不加邻苯三酚溶液，测得A4。O2-·清除率的计算公式:

1.2.4 木瓜酵素清除·O H能力的测定[9]

在比色管中依次加入浓度为6 mmol/L FeS O4溶液2 mL，酵素测试液1 mL，蒸馏水1 mL，浓度为6 mmol/LH2O2溶液2 mL，摇匀后静置10 min，再加入浓度为6 mmol/L水杨酸溶液2 mL，摇匀静置30 min后稀释1倍，再于波长510 nm处测定吸光度A1；用蒸馏水代替水杨酸溶液，测得吸光度A2；用蒸馏水代替酵素测试液，测得吸光度A3。·O H清除率计算公式:

1.2.5 酵素中自由基清除能力总评价

将3种自由基清除能力进行求和，然后平均，即可得到酵素的自由基清除能力综合评价值R%=（R1+R2+R3）/3.

1.2.6 蛋白酶活性的测定[10]

采用GB/T 23527—2009的福林法进行测定。

1.2.7 纤维素酶活性的测定[11]

采用GB/T 2583—2003的还原糖法测定。

1.2.8 脂肪酶活性的测定

采用GB/T 23535—2009的方法进行测定。

1.2.9 淀粉酶活性的测定

采用张思《16种市售酵素食品功能分析与评价》中的方法进行测量。

1.2.10 总酸的测定

采用GB/T 12456—2008的方法进行测定。

1.2.11 有机酸的测定[12]

样品处理:取一定量体积的酵素原液，以转速8 000 r/min离心5 min，取上清液，适当稀释，过0.22μm水膜，待用。

色谱条件:色谱柱Aminex H PX-87H（300 mm×7.8 mm），检测器为紫外检测器，流动相为5 mmol/L硫酸，检测波长210 nm，流速0.6 mL/min，柱温30℃，进样量20μL。

2 结果与分析

2.1 不同发酵方式对所制得的木瓜酵素DPP H·清除能力的影响

根据相关文献和实验室初步试验，建立了1.2.1所示的3种发酵方式，制备出木瓜酵素，每隔5 d进行1次清除自由能力的测定。

不同发酵方式对木瓜酵素DPP H·清除能力的影响见图1。

由图1可知，1号自然发酵工艺所制得的木瓜酵素随着自然发酵过程的进行，DPP H·清除率略有提高；而人工2号和3号发酵工艺在接种酵母菌和德氏乳杆菌后，DPP H·清除率变化缓慢，而接种嗜热链球菌后DPP H·清除率均增加30%左右，和自然发酵DPP H·清除率基本持平。

图1 不同发酵方式对木瓜酵素DPP H·清除能力的影响

2.2 不同发酵方式对所制得的木瓜酵素O2-·的清除能力的影响

不同发酵方式对资丘木瓜酵素O2-·清除能力的影响见图2。

图2 不同发酵方式对资丘木瓜酵素O2-·清除能力的影响

由图2可知，1号自然发酵工艺制备的木瓜酵素对O2-·清除能力比较稳定，增加不多，但比人工接种2号、3号发酵工艺的清除率高5%左右，2号发酵工艺接种德氏乳杆菌后的O2-·清除能力先增后降，在接种嗜热链球菌后的O2-·清除能力增加较快，增加10%左右，最后趋于稳定，而3号发酵工艺接种双歧杆菌后相对稳定，基本和自然发酵的清除O2-·能力持平。从酵素制备工艺控制角度自然发酵和3号发酵工艺优于2号发酵工艺。

2.3 不同发酵方式对所制得的资丘木瓜酵素·O H的清除能力的影响

不同发酵方式对资丘木瓜酵素·O H清除能力的影响见图3。

由图3可知，3种发酵工艺所制得的资丘木瓜酵素在·O H清除能力相差不大，1号自然发酵所得到的酵素清除·O H能力略高，且相对稳定，而3号发酵工艺的·O H清除率下降20%左右。

2.4 3种发酵工艺对所制得的木瓜酵素的自由基清除能力的总评价

图3 不同发酵方式对资丘木瓜酵素·O H清除能力的影响

研究表明，通过3种发酵工艺试验，所制得的木瓜酵素对DPP H·、O2-·、·O H 3种离子的清除能力有一定差异。

不同发酵方式对木瓜酵素清除自由基总能力的影响见图4。

图4 不同发酵方式对木瓜酵素清除自由基总能力的影响

由图4可知，在100 d时，人工接种的发酵工艺所制得的酵素综合清除自由基率比自然发酵的要低5%左右。这与一般植物酵素的接种有些区别，说明木瓜酵素制备还是以自然发酵在清除自由基能力方面效果最好。

2.5 不同发酵工艺对木瓜酵素淀粉酶活力的影响

不同发酵工艺对木瓜酵素产品中淀粉酶活力影响见图5。

图5 不同发酵工艺对木瓜酵素产品中淀粉酶活力影响

自然发酵的淀粉酶活力逐渐增加，而接种发酵工艺的淀粉酶活力基本不变，在100 d，自然发酵的淀粉酶活力最高，大约是人工接种的2号和3号发酵工艺的3倍。说明自然发酵有利于木瓜酵素中淀粉酶的积累。

2.6 不同发酵工艺木瓜酵素中总酸含量和有机酸种类的比较

不同发酵工艺对木瓜酵素产品总酸含量的影响见图6。

图6 不同发酵工艺对木瓜酵素产品总酸含量的影响

由图6可知，不同发酵工艺中酵素的总酸含量存在明显的差异，其总酸含量大小依次为1号自然发酵＞3号接种发酵＞2号接种发酵。其中，自然发酵的1号工艺总酸最高可达6.45 g/kg，说明自然发酵的微生物菌群产酸能力强，但人工接种发酵可以增加乙酸含量，丰富酸的种类。

2.7 不同发酵工艺对资丘木瓜酵素活菌数的影响

酵素品质高低一个重要指标是益生菌数量。通过不同发酵方式得到的资丘木瓜酵素活菌数差别较大。在自然发酵中，容易受环境影响较大，活菌数先增后减，2号发酵工艺也是这个趋势。而3号发酵工艺的活菌数一直保持增长，最高可以达到7×107，是自然发酵2倍多，这对于改善肠道微生物具有重要意义。

不同发酵工艺对木瓜酵素产品活菌数的影响见图7。

图7 不同发酵工艺对木瓜酵素产品活菌数的影响

3 结论

以药食两用的资丘木瓜为主要原料，采用自然发酵、酵母菌-德氏乳杆菌保加利亚亚种-嗜热链球菌先后顺序接种发酵、酵母菌-长双歧杆菌-嗜热链球菌先后顺序接种发酵3种工艺制备木瓜酵素，并对其发酵过程中的3种清除自由基能力、淀粉酶和有机酸进行研究。研究表明不同发酵工艺制得的木瓜酵素均有较强的抗氧化性，对自由基的清除率在80%以上，其中自然发酵制备的酵素清除自由基清除能力更强，工艺相对稳定，人工接种嗜热链球菌后可以提高木瓜酵素清除DPP H·和O2-·的能力，分别提高30%和10%；自然发酵的淀粉酶活力最高，比人工接种的2号和3号发酵工艺提高约2倍，有机酸含量也最高，但人工接种发酵工艺所制得酵素产品活菌数比自然发酵的高，其中3号发酵工艺所得酵素产品的益生菌数量是自然发酵2倍多，有机酸中增加了乙酸种类。后期对自然发酵的菌群分布有待进一步研究。