三株乳酸菌形态特征的研究

乌 素，杨晓艳，班 瑞，李少英

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特 010018）

乳酸菌是一类可以发酵碳水化合物产生乳酸的细菌统称[1]，是日常生活中最常见、应用最广泛的一类菌，目前乳酸菌分为43个属，共有373个种和亚种[2]。嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus） 和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）作为最经典的酸奶发酵剂菌种，二者常一起用于酸奶生产，通过共生作用相互促进，大大提高生长速度并改善了酸奶的品质[3-5]。而植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）可以有效预防冠心病和动脉粥样硬化等心血管疾病[6]，嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌三者以1∶1∶1的比例搭配发酵乳类不会产生拮抗作用[7]。乳酸菌的益处渐渐被人们所认识，再加上人类健康意识的不断提高，乳酸菌的利用程度也大大提高[8]。但不是每个生长阶段的乳酸菌涂片都展现乳酸菌典型的形态，乳酸菌是革兰氏阳性菌[9]，可以根据其生长曲线培养不同生长时间段的菌群进行革兰氏染色、涂片观察，以便更好地观察和认识乳酸菌的典型形态。革兰氏染色法有助于区分革兰氏阳性（G+）菌和革兰氏阴性（G-）菌，大多数革兰氏阳性菌以所产的外毒素致病，而大多数革兰氏阴性菌则以所产的内毒素致病，可根据感染菌株的革兰氏染色结果对相应致病菌菌型及其所产毒素进行判断和及时治疗[10-11]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验用菌

试验组:实验室早期保藏的保加利亚乳酸杆菌Lactobacillus bulgaricus CICC:6064，购于中国微生物菌种保藏管理中心，以下简称为Lb1；保藏的嗜热链球菌Streptococcus thermophilus 6063，购于中国微生物菌种保藏管理中心，以下简称为St1；保藏的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CICC:6238，购于中国微生物菌种保藏管理中心，以下简称为Zb1。

对照组:购买的保加利亚乳酸杆菌Lactobacillus bulgaricus G DMCC1.155，购于广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心，以下简称为Lb2，St1和Zb1。

1.1.2 主要试剂

M RS肉汤培养基（生化试剂），青岛海博生物技术有限公司提供；琼脂（生化试剂），天津市英博生化试剂有限公司提供；氯化钠（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司提供；革兰氏染色液，南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3 主要仪器与设备

K DC-140HR型高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；C P522C型电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司产品；W PL-230BE型电热恒温培养箱、BBS-S DC型洁净工作台，天津市泰斯特仪器有限公司产品；GR60D A型立式自动压力蒸汽灭菌器，致微（厦门） 仪器有限公司产品；D M500+ICC50Leica型显微镜，德国徕卡仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 菌种的活化培养

无菌环境下，取3种菌株的菌种各1支，分别接种到3支灭菌M RS液体培养基中，混匀后在37℃恒温培养箱中培养24 h进行菌种的活化，此为第一代菌。重复上述操作，活化为二代菌[12]。将第二代菌接种至新的M RS液体培养基中，在37℃恒温培养箱中分别培养 8，10，12，14，16，18，20，22，24 h，并进行涂片。

1.2.2 革兰氏染色

将已经涂好的细菌涂片在酒精灯外焰上固定3次。在涂片上滴加适量草酸铵结晶紫染液，初染1 min，水洗，自然干燥；滴加适量碘液，媒染1 min，水洗，自然干燥；滴加适量95%乙醇，脱色30 s，水洗，自然干燥[8，13]；滴加适量番红染液，复染1 min，水洗，自然干燥。在油镜（100×）下镜检，细菌涂片呈现紫色为革兰氏阳性菌，呈现红色为革兰氏阴性菌[12]。盖上盖玻片，用中性树脂粘合边缘，保存涂片以备后续观察。

2 结果与分析

2.1 不同培养时间三株菌的形态特征

将3种菌的第二代菌分别接种至新的M RS液体培养基中，在37℃恒温培养箱中分别培养8，10，12，14，16，18，20，22，24 h。

Lb1，St1，Zb1培养 8～24 h 的形态特征见表 1，Lb2，St1，Zb1培养 8～24 h的形态特征见表 2。

由表1可以看出，保加利亚乳杆菌（Lb1）培养10～16 h，20～24 h时形态特征表现明显且稳定，均为链状，培养8 h呈双球状、培养18 h呈短杆状，可能是由于此时间段的涂片拍摄到的是菌体正处于分裂阶段，形态特征与其他时间段稍有不同，在培养24 h整个过程中，整体形态特征比较稳定，可以看出菌体一直处于快速生长分裂过程中。嗜热链球菌（St1）整个培养过程中形态特征表现明显且稳定，其中培养8～16 h时为双球状，18～24 h为链球状，由此推测嗜热链球菌在培养8～16 h为对数生长期，培养20～24 h进入稳定期。植物乳杆菌（Zb1）整个培养过程中形态特征表现明显且稳定，其中培养8～20 h时为双球状，22～24 h为短棒状，由此推测植物乳杆菌在培养8～20 h为对数生长期，培养22～24 h进入稳定期。

表1 L b1，S t1，Zb1培养8～24 h的形态特征

表2 L b2，S t1，Zb1培养8～24 h的形态特征

由表2可以看出，保加利亚乳杆菌（Lb2）培养24 h形态特征表现明显且稳定，均为长杆状，由此推测保加利亚乳杆菌已经进入稳定期，呈现菌体的典型形态特征。植物乳杆菌（Zb1）培养18 h之后形状和18 h之前几个时间段菌的形状不同，出现了短棒状，因此推测植物乳杆菌在形状发生变异之后，可以通过复壮方法实现菌形态的恢复。

由表1和表2可以看出，用于革兰氏染色试验的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌菌龄以16～18 h为宜。这是因为细菌在一般适宜的培养条件下，十几个小时即进入对数生长期。若培养时间过长，细菌进入稳定期或衰亡期，随着衰退型或死亡菌体的大量出现及菌体的自溶，其细胞壁失去了保留结晶紫的能力，就可能会表现出阴性反应，且菌龄过长，菌体会出现异常形态，着色力会大为减弱[14]。

2.2 不同染色时间对涂片效果的影响

不同染色时间对涂片效果的影响见表3，A组染色时间3株菌的形态特征见图1，B组染色时间3株菌的形态特征见图2，C组染色时间保加利亚乳杆菌的形态特征见图3。

表3 不同染色时间对涂片效果的影响

图1 A组染色时间3株菌的形态特征

图2 B组染色时间3株菌的形态特征

图3 C组染色时间保加利亚乳杆菌的形态特征

由图1可以看出，将酒精脱色时间延长至50 s时，A组3株菌的细胞颜色较浅，且一部分细胞边缘模糊。因此推测可能是酒精脱色时间太长，导致细胞壁部分被破坏。由图2可以看出，将初染、媒染、复染的时间增加到3 min时，B组图片中菌的颜色明显，呈现偏蓝色且不均匀。由图3可以看出，番红着色能力较弱，菌片呈现淡粉色，因此推测图2中出现大面积蓝色，可能是番红没有草酸铵结晶紫染液的着色能力强。

3 结论

同一组试验当中，每隔2 h同一菌株的形态基本没有发生改变，因此推测每2 h刚好是乳酸菌同一生长期。3株乳酸菌在培养16～18 h时，为对数期末期，革兰氏染色试验菌体呈现典型形态。植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌的形态不是典型的杆状，可以作为特殊形态标准涂片供观察学习。在形状发生变异之后，可以通过复壮方法实现菌形态的恢复。在对菌体染色过程中，应注意控制好菌龄和脱色时间[15-17]，才能得到正确的染色结果。