天山堇菜凉茶制备工艺研究

李乐，孙园

（1.新疆植物药资源利用教育部重点实验室，新疆 石河子 832002；2.石河子人民医院，新疆 石河子 832002）

天山堇菜（Viola tianschanica Maxim）为堇菜科堇菜属的全草，生于山坡草地、高山和亚高山草甸及水沟边，海拔在3 000 m 以上，主要分布于新疆天山山脉。其气微，味微苦辛，清热解毒，具有调理、软化、发汗的作用[1]。全草含黄酮类、挥发油、氨基酸、生物碱、黏液类皂苷、鞣质等物质，具有广泛的生物活性。其中黄酮类有效成分对治疗冠心病、老年痴呆、脑血栓及消除自由基、抑菌、抗癌等方面有显著效果，目前市场已开发出多种以黄酮为主要活性成分的药品和保健食品[2-4]。课题组在天山堇菜的前期研究过程中，首次发现天山堇菜提取液能够显著降低糖尿病小鼠血糖水平，该功效可为天山堇菜的开发提供更广阔的思路。

凉茶，是药茶、保健茶的一种。顾名思义，是指由药性寒凉的药物组成，“凉”即寒凉、苦凉、甘凉、辛凉，“茶”即茶叶。综合起来，凉茶是用茶叶制成具有寒凉清热、生津止渴作用的一种茶饮料，因其具有简、便、廉、验的特点，而为广大群众所接受。目前，主流凉茶产品中，都添加了蔗糖用以改善口感，这极大限制了凉茶在糖尿病人群中的应用。结合天山堇菜的降糖效果，课题组选取天山堇菜提取液为主要成分，同时搭配凉茶产品中普遍使用的金银花、野菊花、夏枯草、甘草和陈皮这5 种清热中草药。金银花性甘寒气芳香，用于各种热性病，均效果显著；野菊花可清热解毒，疏风散热；夏枯草具有清肝、散结、利尿等作用；甘草是一种补益中草药，有润肺、解毒、调和诸药的功效；陈皮能健脾理气[5]。凉茶中去除蔗糖改用其他甜味剂，制备出具有一定降糖效果的无糖凉茶，同时对天山堇菜凉茶工艺进行考察，并对其口感和添加剂进行优化。通过将天山堇菜这一新疆特种植物加入到凉茶当中，使得凉茶保留了原有清热祛火的功效，适合更广泛的人群使用。

1 材料与方法

1.1 仪器

UV-2041 紫外分光光度仪：日本岛津公司；石英比色皿：宜兴市晶科光学仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市英峪予华仪器厂；BP211D 十万分之一电子分析天平：德国Sartorius；RE-201D 恒温水油浴锅：上海普渡生化科技有限公司，TP300 超声波提取器：天鹏电子新技术（北京）有限公司。

1.2 样品与试剂

天山堇菜：新疆和田地区，经石河子大学中药系李鹏副教授鉴定为堇菜属的天山堇菜全草；95 %乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；三氯化铝：天津福晨化学试剂有限公司；氢氧化钠：天津市大陆化学试剂厂。以上均为分析纯。

1.3 天山堇菜的提取工艺考察

在前期的试验基础研究中，比较了回流提取法、索氏提取法及超声提取法，以总黄酮为指标进行效果评价，结果表明回流提取效率最高，且操作简单，仪器易得，故选择该方法作为提取工艺考察方法。

1.3.1 芦丁对照溶液的制备

精密称取芦丁对照品20.54 mg，置25 mL 容量瓶中，加95%乙醇适量，超声处理溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀即得。取对照品溶液0.5 mL 至10 mL 试管中，加入 5%NaNO3溶液 0.5 mL，摇匀，放置 5 min，加5%AlCl3溶液 0.5 mL，放置 6 min，加 1 mol/L NaOH 溶液4 mL，加95%乙醇至10 mL，摇匀，放置10 min，以95%乙醇为空白参照，扫描吸收曲线，得在510 nm 处有最大吸收。

1.3.2 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别置于10 mL 试管中，各加适量95%乙醇，采用硝酸铝比色法测定，加入5%NaNO3溶液0.5 mL，摇匀，放置 5 min，加 5 % AlCl3溶液 0.5 mL，放置 6 min，加1 mol/L NaOH 溶液4 mL，加95%乙醇至10 mL，摇匀，放置10 min，以相应试剂为空白，按紫外-可见分光光度测定方法，于510 nm 的波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得到标准方程A=1.428 7c + 0.008 6（R2= 0.995 2，浓度范围0.082 16 mg/mL～0.657 29 mg/mL）。

1.3.3 不同提取温度对天山堇菜总黄酮提取率的影响

称取天山堇菜粉末2.0 g，以蒸馏水提取，固定料液比 1∶20（g/mL），回流提取时间 40 min，提取 1 次，提取溶液处理后测定吸光度，代入标准曲线中计算，最终得总黄酮含量。

1.3.4 不同料液比对天山堇菜总黄酮提取率的影响

称取天山堇菜粉末2.0 g，蒸馏水提取，固定水浴温度80 ℃，回流提取时间为40 min，提取1 次，考察料液比分别 1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）时对天山堇菜总黄酮提取率的影响。

1.3.5 不同提取次数对天山堇菜总黄酮提取率的影响

称取天山堇菜粉末2.0 g，蒸馏水提取，固定料液比 1∶20（g/mL），回流提取时间 40 min，水浴温度 80 ℃，考察提取 1 次、2 次、3 次、4 次、5 次对天山堇菜总黄酮提取率的影响。

1.3.6 不同提取时间对天山堇菜总黄酮提取率的影响

称取天山堇菜粉末2.0g，蒸馏水提取，固定提取温度 80 ℃，料液比 1∶20（g/mL），提取 1 次，考察提取时间分别为 15、30、45、60、75min 时对天山堇菜总黄酮提取率的影响。

1.3.7 正交优化试验

在单因素试验的基础上，称取天山堇菜2.0 g，根据单因素试验优选的最佳提取条件，按照L9（34）正交表设计提取方案，以黄酮提取率为指标，进行正交优化提取试验。

1.4 凉茶制备工艺

1.4.1 工艺流程

凉茶的主要制备工艺为：原料粉碎—提取—过滤—离心分离—调配—杀菌。基本操作步骤如下：原料用粉碎机粉碎后过20 目筛得到的粉末，密封贮藏备用。以正交试验优化后的提取工艺提取天山堇菜，抽滤，得到清液并冷却[6]。将过滤后得到的清液置于3 000 r/min 的离心机中离心15 min，以分离清液中的残渣和杂质。

1.4.2 茶提液制备

将野菊花、金银花、夏枯草、陈皮、甘草按 3∶1∶1∶2∶2（质量比）称取适量，加 50 倍水，95 ℃下浸提45 min，提取2 次。浸提液4 层纱布过滤，冷却后置冰箱-4 ℃过夜，冷冻离心除“茶乳凝”等沉淀物，取上清液备用。

1.4.3 调配

按照天山堇菜提取液20%，茶提液30%的比例混合两种提取液，并加入一定比例的木糖醇、麦芽糖醇、结晶山梨醇、稳定剂、柠檬酸，充分溶解后加入等体积的水，再搅拌均匀[7]。

1.4.4 杀菌

在85 ℃～90 ℃热水浴中保温杀菌20 min，取出用自来水冷却至室温。

1.4.5 口感测试

口感测试选择成年大学生志愿者50 人，男性与女性各25 人。气味评分选择有无不良气味为指标，分数段1 分～10 分进行打分，口感评分选择黏稠感、甜味、腥味、苦涩感、清凉感5 项为指标，各指标1 分～10 分进行打分后求均值。评分标准将气味评分与口感评分3∶7 的比例进行评价，总分 10 分[8]。

1.4.6 甜味剂与柠檬酸的筛选

作为无糖食品的甜味剂，功能性糖醇应为首选。结合木糖醇、麦芽糖醇、结晶山梨醇这3 种常用功能性甜味剂的特点和生产应用现状，本试验选用木糖醇、麦芽糖醇为主甜味剂。木糖醇具有清爽纯正的滋味，麦芽糖醇能使产品细腻，甜味可口，并延长保存期，辅以结晶山梨醇可进一步调节口感[9-10]。采用L9（34）正交设计，进行试验，并在杀菌后，进行口感测试并评分。

1.4.7 稳定剂的筛选

在饮料中使用稳定剂，可以提高饮料的稳定效果，但也有可能影响本凉茶的口感，在果胶、羧甲基纤维素（caboxy methyl cellulose，CMC）、黄原胶 3 种常用稳定剂中筛选[11-12]，以口感评价。

1.5 天山堇菜凉茶安全性考察

为确保天山堇菜凉茶的饮用安全性，采用小鼠灌胃实验进行考察。选取SPF 级雄性昆明小鼠25 只，体重均为30 g 左右，并进行一周的适应性喂养，测定血糖含量，采用优化后方案制备凉茶，对其进行灌胃处理，按照小鼠的体积计算给予小鼠灌胃20 d，末次给药后禁食不禁水12 h 后尾部取血，用血糖仪测定血糖值。在实验前、实验中、实验后检测小鼠的体重的变化，每3 d 称取一次小鼠的体重并记录数值，对小鼠体重的前后变化进行比较。

2 结果与分析

2.1 提取温度对试验结果的影响

考察提取温度分别为 50、60、70、80、90 ℃时对天山堇菜总黄酮提取率的影响，结果见表1。

提取率由70 ℃开始明显提升，80 ℃达到最大值，90 ℃开始下降。故选择70、80、90 ℃为正交试验条件。

表1 提取温度单因素考察表Table 1 Single factor study table of extraction temperature

2.2 料液比对试验结果的影响

通过考察不同比例料液比对天山堇菜总黄酮提取率的影响，结果见表2。

表2 料液比单因素考察表Table 2 Single factor inspection table of Material-liquid ratio

提取率在料液比1∶10（g/mL）时开始明显提升，随着料液比增大逐渐增大，1∶30（g/mL）之后提高较小，出于成本考虑选择 1∶10、1∶20、1∶30（g/mL）3个水平为正交试验条件。

2.3 提取次数对试验结果的影响

考察不同提取次数对天山堇菜总黄酮提取率的影响，结果见表3。

表3 提取次数单因素考察表Table 3 Single factor study table of extraction numbers

随着提取次数的增多，提取率增高，但3 次之后增高幅度不明显，出于成本考虑选择1 次、2 次、3 次为正交试验条件。

2.4 提取时间对试验结果的影响

考察不同提取时间对天山堇菜总黄酮提取率的影响，结果见表4。

随着提取时间的增加，提取率增高，45 min 后增高幅度不明显，故选择15、30、45 min 为正交试验条件。

表4 提取时间单因素考察表Table 4 Single factor study table of extraction time

2.5 正交试验结果

试验设计的因素水平见表5，方差分析见表6。

表5 天山堇菜提取正交试验因素水平表Table 5 Factor table of orthogonal experiment of Viola tianschanica Maxim

表6 L9（34）正交试验结果Table 6 L9（34）Orthogonal test results

对试验结果进行直观分析，可以看出以上因素对天山堇菜中总黄酮提取率的影响优先顺序为B＞D＞C＞A，提取率受料液比影响最大，天山堇菜总黄酮提取最佳工艺为A3B1C2D2，即提取温度为90 ℃，料液比为1∶10（g/mL），提取次数 2 次，提取时间为 30 min。

2.6 验证试验

选取正交试验优化出的最佳提取工艺进行验证试验，重复3 组，得总黄酮平均提取率为1.21%，高于其余正交试验组。

2.7 甜味剂和柠檬酸的配比试验结果

确定天山堇菜凉茶中甜味剂和柠檬酸的配比，试验设计因素水平见表7。

表7 甜味剂和柠檬酸配比正交试验因素水平表Table 7 Factor table for orthogonal experiment of sweetener and citric acid ratio

通过L9（34）正交设计试验，确定天山堇菜凉茶中甜味剂和柠檬酸的配比，试验效果以感官评定为标准，总分为10 分，结果见表8。

表8 糖酸比正交试验结果Table 8 Results of sugar acid ratio orthogonal experiment

分析可知影响天山堇菜凉茶口感与滋味的主次因素顺序为C＞B＞A＞D，因此根据正交试验的优选组合为A2B2C3D3。即每百毫升凉茶中加入天山堇菜提取液20 mL、茶提取液 30 mL、水 50 mL、木糖醇 3 g、麦芽糖醇3 g、柠檬酸0.08 g、结晶山梨醇1.5 g、为最优方案，按照该工艺进行验证试验，6 次口感测试评分和为56.8，证明该比例制备出的凉茶口感较好。

2.8 不同稳定剂对于口感的影响

选择3 种稳定剂进行口感评价，结果见表9。

表9 不同稳定剂对口感影响Table 9 Effects of different stabilizers on taste

通过对比试验，确定天山堇菜凉茶中加入果胶可达到很好的外观品质与口感。

2.9 天山堇菜凉茶安全性实验结果

为确保天山堇菜凉茶的饮用安全性，采用小鼠灌胃实验进行考察，结果见表10。

表10 天山堇菜凉茶对正常小鼠影响情况Table 10 Influence of herbal tea on normal mice

实验表明，连续灌胃20 d 后，小鼠的进食量与饮水量稍有增加，体重与血糖无明显变化，无其他异常体征变化，20 d 期间小鼠全部存活，证明该凉茶产品对正常小鼠无毒副作用，对其正常血糖值不产生影响。

3 结论

目前国内外对天山堇菜的研究很少，其作为新疆的道地药材有很多价值和潜力没有发挥，其众多的药用和保健价值没有被开发。国内针对天山堇菜的研究，主要对其化学成分进行研究，如总黄酮、多糖、鞣质、微量元素等含量的研究，尚无食品、保健品方面的应用，该植物的研究潜力还有待开发，课题组在试验中，通过单因素试验考察了提取时间、液料比、温度对天山堇菜总黄酮提取的影响，在此基础上采用正交提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺，并利用优化后的提取工艺得到天山堇菜提取液，同时通过口感测试，优选出最佳糖酸比及稳定剂的配方工艺，每百毫升凉茶中加入天山堇菜提取液20 mL、茶提取液30 mL、水 50 mL、木糖醇 3 g、麦芽糖醇 3 g、结晶山梨醇1.5 g、柠檬酸0.08 g，同时添加果胶0.1 g，制备出的凉茶具有良好的口感及外观，将提取液作用于糖尿病小鼠模型中，发现了天山堇菜的降糖效果。这也是国内首次在该植物研究中发现其降糖作用。结合其降糖功效及市面上凉茶产品的局限性，以天山堇菜为主要配方制备凉茶，并对其凉茶制备和配方进行考察，得到了具有清香气味，酸甜适口，清爽宜人的无糖凉茶，动物实验表明该凉茶对正常血糖不产生影响，为该种植物未来的开发利用提供了理论基础，也为新疆特种植物的研究与开发提供有益参考。