离子液体酶法微波辅助提取山楂有机酸工艺优化及成分分析

封易成，牟德华

（河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050000）

山楂属于蔷薇科（Rosaceae），它在欧洲和中国已经成为预防和治疗心脏病的多效传统药物[1-3]。追溯到20世纪初，山楂被用于改善血液循环，并治疗失眠[4-6]。在英国，山楂用于心肌功能障碍，高血压和动脉粥样硬化[7]。其果实在中国用于治疗血液循环障碍[8]。山楂果实，叶子和花的提取物可以预防高血压和心力衰竭等疾病[9-10]。山楂的水提取物具有降血脂、抗炎和血液流变学的改善等多种功能[11-13]。植物性果实中的有机酸在预防饮食引起的慢性疾病（骨质疏松症，肥胖）方面发挥重要作用[14-15]。

离子液体（ionic liquid，ILs）被定义为有机盐，由大分子有机阳离子和有机或无机阴离子组成[16]。离子液体具有许多独特的性质，如化学稳定性、热稳定性、不可燃性、高导电性，并且表现出对各种化合物良好的溶解性[17-20]。实际上，离子液体被认为是“绿色”溶剂的原因在于离子液体的挥发性非常低，可以避免大气污染[21]。使用离子液体比使用普通有机溶剂的一个明显的优点是离子液体的极性、疏水性、黏度和溶剂混溶性可以有效的通过改变阳离子、阴离子和连接的取代基进行调整[22-23，17]。离子液体作为绿色溶剂，在环境友好型和回收利用方面具有无可替代的优势和潜力，非常适用于对安全性要求较高的医药和食品行业[24]。

微波辅助提取在食品方面的应用之前也有所报道。微波辅助提取是一种有前景且有效的技术，可在更短的时间内保证更高的产量[25-26]。微波使得细胞破裂，从而有利于提取溶剂进入以溶解目标化合物，可以更快的提取并防止目标化合物的降解[27]。

本文采用了一种使用离子液体酶法微波辅助提取山楂有机酸的新技术，旨在探索一种绿色、便捷提取有机酸，同时对其分子结构造成最小可能损害的方法。试验条件使用响应面法进行了优化。最后，将这种方法与其他提取方法的结果进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂来自河北省承德兴隆县，为新鲜的铁山楂，筛选直径范围为2.3 cm～2.8 cm，每个鲜果质量为9.3 g～11.3 g 之间，平均含水率为74.6%。

纤维素酶（酶活≥400 U/mg）、1-丁基-3-甲基咪唑磷酸氢二盐（1-Butyl-3-methylimidazolium hydrogen phosphate di-salt [Bmim]H2PO4）、溴化 1-丁基-3-甲基咪唑（1-Butyl-3-methylimidazolium bromide [Bmim]Br）、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸盐（1-Butyl-3-methylimidazolium sulfate [Bmim]2SO4）、溴化 1-己基-3-甲基咪唑（1-Hydroxy-3-methylimidazolium bromide [Hmim]Br）、氯化 1-己基-3-甲基咪唑（1-Hexyl-3-methyl imidazole chloride [Hmim]Cl）、溴化1-乙基-3-甲基咪唑（1-Bromo-3-methylimidazolium bromide [Emim]Br）：上海宝曼生物科技有限公司；没食子酸、丁二酸、DL-苹有机酸：天津市大茂化学试剂厂；磷酸二氢铵：天津市精细化工有限公司；柠檬酸、酒石酸：天津市永大化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）：天津星马克科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

MICHEM ME6-TC 微波样品处理平台：北京盈安美诚科学仪器有限公司；LC-20AT SHIMADZU 高效液相色谱仪：日本岛津公司；Adventurer 分析电子天平：美国奥豪斯仪器有限公司；78-1 型磁力搅拌器：江苏大地自动化仪器厂；VaCo2 冷冻干燥机：德国ZIRBUS有限公司；HC-200 型华晨高速多功能粉碎机：浙江省永康市金穗机械制造厂。

1.3 方法

1.3.1 山楂粉的制备

使用冷冻干燥机将去核山楂冷冻干燥，用粉碎机打碎，过40 目筛，得到山楂粉，放于干燥器中备用。

1.3.2 浸泡法提取山楂有机酸

山楂有机酸的浸泡提取法参照《中国药典》（一部）[28]，称取山楂细粉1 g，加入去离子水100 mL，室温浸泡4 h，时时振摇，滤过，量取滤液25 mL，加去离子水50 mL，加酚酞指示液2 滴，用0.1 mol/LNaOH 滴定，每 1 mL NaOH 滴定液相当于 6.404 g 枸橼酸（C6H8O7），含有机酸按枸橼酸计。

1.3.3 离子液体酶法微波辅助制取山楂有机酸

称取2 g 山楂粉于圆底烧瓶中，加入纤维素酶和离子液体水溶液混匀，置于微波样品处理平台中提取9 min，离心得上清液，取1 mL 上清液，加去离子水20 mL，用0.1mol/LNaOH 滴定，计算有机酸含量。

1.3.4 单因素试验

单因素试验各因素水平设置如下：离子液体[Bmim]H2PO4、[Bmim]Br、[Bmim]2SO4、[Emim]Br、[Hmim]Br、[Hmim]Cl；离子液体浓度为 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L；纤维素酶添加量为样品质量的0%、0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%；液料比为 15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），反应温度为 35、45、55、65、75 ℃；提取时间为 10、15、20、25、30、35 min。分别考察上述 5个因素对山楂有机酸含量的影响。

1.3.5 提取工艺优化

在单因素试验结果的基础上，采用响应面分析法，利用Box-Behnken 试验原理，以离子液体添加量、纤维素酶添加量、液料比及提取时间为变量，有机酸含量为响应值，选用二次回归方程，进行有机酸提取工艺条件的优化，见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Coded and actual values for the factors used in response surface analysis

1.3.6 有机酸组分的液相色谱测定

液相色谱条件：选用迪马Platisil ODS C18[4.6×250 mm ID，5 μm]色谱柱，0.02 mol/L NaH2PO4（pH2.9）∶乙腈（98∶2，体积比）缓冲溶液为流动相，控制流速为0.5 mL/min，柱温30 ℃，检测波长213 nm，进样量20 μL。用草酸、酒石酸、L-苹有机酸、抗坏血酸、柠檬酸、没食子酸的标准品做标准曲线，将测定样品的色谱峰与标准曲线进行比对计算其含量。

1.4 统计学分析

用SPSS 24.0 软件进行统计分析，组间数据比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），所得数据以±s表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 离子液体种类对有机酸含量的影响

离子液体的种类对提取效果影响较大，为了寻找最佳的离子液体，研究了6 种不同阴离子和碳链长度作为阳离子的离子液体，因为有机酸大部分为水溶性化合物，所以选取的6 种离子液体均为亲水性。离子液体种类对山楂有机酸含量的影响见图1。

图1 离子液体种类对山楂有机酸含量的影响Fig.1 Effects of ionic liquids on hawthorn acid content

如图1所示，取同样浓度的不同阴阳离子的离子液体提取山楂中的有机酸时，用[Bmim]Br 提取得到的有机酸含量最高，且具有显著性，离子液体的亲脂性随着烷基链长度的增加而增加，[Bmim]+为短链阳离子，亲水性强，[Bmim]Br 具有很高的溶解纤维素的能力，溶解了植物细胞的壁，这有助于有机酸的提取[29]。这一现象可能和 [Bmim]Br 与有机酸之间的氢键有关[30]。所以选取[Bmim]Br 作为提取剂用于进一步提取研究。

2.1.2 离子液体浓度对有机酸含量的影响

离子液体浓度对有机酸含量的影响结果见图2。

图2 离子液体浓度对山楂有机酸含量的影响Fig.2 Effect of ionic liquid concentration on hawthorn acid content

提取有机酸含量随着离子液体浓度增加而增加，到0.04 mol/L 时含量达到最高。这是因为离子液体可以溶解更多的植物纤维并促进溶液进入细胞[31]。同时，离子液体的微波吸收能力和传输能力通过增加其浓度而增强[32-33]。离子液体具有较强的催化活性，在与酶结合提取植物有机酸时，酶活性都比其在有机溶剂中高[34]，此外，高浓度离子液体穿透细胞壁的能力增强，从而提高了提取能力[35]。适当的离子液体添加能够增强纤维素酶的催化活性，但当离子液体添加量过大时，[Bmim]Br 浓度越大，黏度越大，[Bmim]Br 更难以穿透样品基质，阻碍了纤维素酶与底物的结合，从而影响到纤维素酶的催化作用，降低酶解速率[36，18]。从图2中可以看出，当离子液体浓度为0.04 mol/L 时，目标分析物的含量最高。考虑到提取率和经济节能，选择0.04 mol/L[Bmim]Br 作进一步试验。

2.1.3 提取温度对有机酸含量的影响

不同提取温度对有机酸含量的影响，试验结果如图3所示。

图3 提取温度对山楂有机酸含量的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on hawthorn acid content

随着提取温度升高到55 ℃，提取有机酸含量增加，随着温度继续升高，有机酸提取含量呈现先降低后升高的趋势，然后随着温度的升高有机酸出现降低后再次升高的趋势。这是由于纤维素酶在较高温度下逐渐失活，而随着温度的升高，细胞壁在高温下遭到破坏，同时高温有利于降低离子液体的粘度，提高离子液体的扩散能力和溶解性，从而使提取得到的有机酸含量升高[37]。为了使有机酸不受高温破坏同时降低耗能，选择55 ℃的提取温度用于进一步分析。

2.1.4 纤维素添加量对有机酸含量的影响

纤维素添加量对有机酸含量的影响，结果如图4所示。

山楂中的有机酸存在于在细胞内，提取的过程实际是有效成分溶解并扩散到溶剂中的过程，提取过程的阻力来源于细胞壁、固液界面和流体膜，为了提高提取效率采用破坏细胞壁的方法，有效降低提取过程的阻力。细胞壁中的纤维素分子是由D-葡萄糖残基通过β-（1，4）糖苷键聚合而成的，它不溶于一般的水和有机溶剂，当纤维素酶破坏β-（1，4）糖苷键，可将细胞壁中的纤维素分子酶解成小分子或水溶性物质，从而使山楂中的有机酸释放，提高提取效率[38]。当纤维素酶添加量在0.2%～1%时，山楂有机酸含量随着加酶量的增加而增加，当纤维素酶添加量为1%时有机酸含量达到最高值152.399 mg/g，此时纤维素酶的添加量已能够将山楂细胞壁破坏完全，添加过量的纤维素酶对提高含量没有很大的影响。

2.1.5 液料比对有机酸含量的影响

液料比对有机酸含量的影响见图5。

图4 纤维素酶添加量对山楂有机酸含量影响Fig.4 Effect of cellulase addition on hawthorn acid content

图5 液料比对山楂有机酸含量的影响Fig.5 Effect of liquid ratio on hawthorn acid content

当液料比从 15∶1（mL/g）变为 30∶1（mL/g）时，提取收率提高。可能是因为离子液体促进微波能量的传输，促进了有机酸的有效溶解。当液料比大于30∶1（mL/g）时，可能由于纤维素酶遭到稀释，含量较低，从而降低了有机酸的提取含量。当采用响应面优化提取条件时，使用 25∶1、30∶1、35∶1（mL/g）液料比进一步分析。

2.1.6 提取时间对有机酸含量的影响

为了评估时间对提取的影响，用不同的提取时间进行了一系列的试验。提取时间对有机酸含量的影响结果见图6。

图6中的结果表明提取产量随着提取时间的增加而增加。延长提取时间有优点和缺点。一方面细胞结构破坏，有利于有机酸的溶解。另一方面，热敏性物质被破坏，并且生物活性也下降[39]。从图6可以看出，随着提取时间的延长，有机酸提取含量升高，到25 min时达到提取含量最高点。与传统水浸泡法相比，离子液体酶法有效的缩短了提取时间。在进一步的单因素试验中用25 min 作为提取时间。当优化提取条件时，20、25 和30 min 的提取时间用于进一步分析。

图6 提取时间对山楂有机酸含量的影响Fig.6 Effect of extraction time on hawthorn fruit acid content

2.2 响应面优化试验设计及结果

2.2.1 Box-Behnken 试验设计及结果

以离子液体浓度、纤维素酶添加量、液料比、提取时间为自变量，以有机酸含量为响应值，响应面试验分析及结果如表2所示。

表2 响应面试验分析及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

续表2 响应面试验分析及结果Continue table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 模型方程的建立及显著性检验

采用Design-Expert 软件对表2所得的有机酸含量试验数据进行回归拟合，如表3所示。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the fitted quadratic regression model for extraction yield

由表3得到A 离子液体浓度、B 液料比、C 纤维素酶添加量、D 时间为自变量对有机酸含量的回归方程：有机酸含量=163.93-1.73A-0.53B+1.75C+0.36D-0.75AB-1.05AC-1.48AD+0.35BC+0.82BD+0.32CD-7.65A2-5.11B2-7.92C2-4.39D2。

通过回归模型的方差分析表得出，整体模型的P值为0.021 7 小于0.05，表明二次模型显著，失拟项P值为0.296 06 大于0.05，不显著，表明此二项模型拟合有效，可以分析和预测各因素与响应值的关系。各影响因素的主次顺序为：C 纤维素酶添加量＞A 离子液体添加量＞B 液料比＞D 时间。

2.2.3 各因素的响应面分析

为了说明离子液体添加量（A），液料比（B），纤维素酶添加量（C）和提取时间（D）和之间的相互作用，绘制了响应面的三维图像，从响应面分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用。根据回归方程得出不同因素的响应面分析图及相应等高线图结果见图7。

各因素交互作用对山楂有机酸含量的影响，若曲线越陡峭，则表明该因素对有机酸含量的影响越大，相应表现为响应值变化的大小[40]。而由等高线图可以看出存在极值的条件应该在圆心处。从表3回归分析结果可以看出，纤维素酶含量对有机酸含量影响最大。

2.3 最佳试验条件预测与验证

由Design-Expert 软件可求得回归方程的极值点，得到有机酸提取最佳工艺条件为：离子液体溴化-1-丁基三甲基咪唑浓度为0.039 mol/L、纤维素酶添加量质量分数 1.059%、液料比 29.84∶1（mL/g）、提取温度55 ℃、提取时间25.3min，在此条件下有机酸的理论预测含量为164.159 mg/g。对最佳提取条件进行验证试验，考虑到实际操作，将最佳工艺参数修正为：离子液体浓度为0.039mol/L、纤维素酶添加量质量分数1.06%、液料比 30∶1（mL/g）、提取温度 55 ℃、提取时间 25 min。测得有机酸含量为161.863 mL/g，与预测值接近。

图7 两因素交互作用对山楂有机酸含量的响应面和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots of ramsaric acid content by two-factor interactions

2.4 有机酸提取物的高效液相色谱分析结果

按最佳试验条件对两种提取方式得到的有机酸化学成分进行测定分析，定性结果及相对含量见表4。

表4 山楂有机酸中主要成分及含量Table 4 Hawthorn organic acids in the main components and content

由表4可以看出，由传统水浸泡法和离子液体酶法两种方法提取的山楂有机酸成分相同，采用两种方法提取有机酸，其中柠檬酸含量最高，分别占总有机酸的88.641%和90.858%；其次含量较高的为酒石酸，分别占测得有机酸的6.313%和4.959%；含量最少的为没食子酸。从提取的主要成分及相对含量上来看，两种提取方法并没有很大的区别，但离子液体酶法微波辅助提取可以破坏山楂细胞壁，使山楂有机酸更容易被提取出来，减少了一些热敏性成分的破坏，使得提取得到相对含量有所提高。

两种提取方法得到的有机酸主要成分均为柠檬酸，PENGZHAN LIU 等[41]测定22个品种山楂中有机酸的主要成分均为柠檬酸，占总酸含量的55%～82%。Baoru Yang 等[42]测定的10个品种山楂中有机酸的主要成分也均为柠檬酸。有机酸含量也可能影响果实中酚类化合物的稳定性和浆果对健康的促进作用，糖分含量和糖酸比的不同也会引起品种和品种间感官特性和生理效应的差异[43]。

3 结论

本研究以山楂为原料，采用响应面试验设计对离子液体酶法微波辅助提取有机酸的工艺进行优化，最佳提取条件为：离子液体溴化-1-丁基三甲基咪唑浓度为0.039 mol/L、纤维素酶添加量质量分数1.059%、液料比 29.84∶1（mL/g）、提取温度 55 ℃、提取时间25.3 min，在此条件下有机酸含量为164.159 mg/g。离子液体酶法微波辅助提取有机酸的方法与传统水浸泡法相比，缩短了提取时间，提高了提取山楂有机酸的含量，但含量最高的成分均为柠檬酸。

本文提出了一种从山楂果实中提取有机酸的有效方法，并提出了一种离子液体酶法微波辅助提取山楂有机酸的新技术，希望这种技术在深入的研究之后更广泛的应用于医药及食品行业中。