南瓜多糖的体外抑菌活性

翟娅菲，张星稀，相启森，赵伦旭，何乃磊，申瑞玲

（1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450002；2.食品生产与安全河南省协同创新中心，河南 郑州 450002）

南瓜（Cucurbit moschata Duch.）富含多种营养物质[1]，具有润肺、健脾胃、消炎止痛、缓解腹胀等功效，是受广大群众喜爱的一种瓜类蔬菜。南瓜中的生物活性化合物丰富，尤其是具有防治糖尿病功效的南瓜多糖倍受关注[2-3]。南瓜多糖能够显著增加四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的胰岛素水平，并能修复受损的胰岛组织与肝组织细胞。南瓜多糖还可显著提高血清及肝组织中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的量，并使肝组织中丙二醛和NO 的含量显著降低[4]。近年来，关于南瓜多糖的研究主要集中于其分离提取方法及其防治糖尿病的机理[5-6]，而对南瓜多糖的其它功效研究较少。早期研究报道南瓜多糖具有抑菌效果[7-8]，然而不同因素对南瓜多糖体外抑菌效果的影响仍然未知。本研究分别探索了南瓜多糖对属于革兰氏阴性菌的大肠杆菌、属于革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌和属于真菌的鲁氏接合酵母的抑制作用，就不同浓度、温度、pH 值对南瓜多糖体外抑菌效果的影响进行了研究，确定了南瓜多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度，以期为南瓜多糖的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜南瓜：市售；无水乙醇、丙酮、HCl、NaOH 等试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；Luria-Bertani 培养基（LB）和酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD）：青岛海博生物技术有限公司；大肠杆菌O157：H7 （Escherichia coli O157：H7）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）：郑州轻工业大学食品营养与安全实验室所有。

1.2 试验方法

1.2.1 南瓜多糖的制备

选取肉质呈橘黄色的成熟期较长的南瓜，清洗表面并去掉南瓜外表皮及籽粒，切成薄片后烘干。烘干后冷却至室温的南瓜片经粉碎机粉碎后过40 目筛，所得南瓜粉用于南瓜多糖的进一步提取。取一定量南瓜粉并加入35 倍的蒸馏水，于80 ℃搅拌浸提2 h。过滤后取上清液并适当浓缩，然后用4 倍体积的95%乙醇沉析多糖，4 ℃下静置12 h 后过滤取沉淀。所得沉淀分别经95%乙醇、丙酮和无水乙醇洗涤去除杂质后，干燥保存。

1.2.2 菌种的活化及菌悬液的制备

从保存斜面上分别挑取一环大肠杆菌O157：H7和金黄色葡萄球菌接种到灭菌的LB 液体培养基中，于37 ℃、220 r/min 条件下恒温震荡培养12 h 以活化菌种。挑取一环鲁氏接合酵母接种到灭菌的YPD 液体培养基中，于30 ℃、220 r/min 条件下恒温震荡培养24 h 以活化菌种。以无菌生理盐水稀释活化的菌悬液，使其浓度为107cfu/mL～108cfu/mL。

1.2.3 抑菌活性的测定方法

稀释后的大肠杆菌O157：H7 和金黄色葡萄球菌菌悬液各取150 μL，分别加到LB 固体培养基平板上并涂布均匀。取150 μL 稀释后的鲁氏接合酵母菌悬液，均匀涂布到YPD 固体培养基表面。待菌液渗入固体培养基后，在每个平板上放置4个灭菌的牛津杯。其中3个各加入100 μL 经同一条件处理的待测样品，另一个加入等量无菌水作为阴性对照。含大肠杆菌O157：H7 和金黄色葡萄球菌的平板经处理后放置于37 ℃恒温培养箱中培养20 h，含鲁氏接合酵母的平板置于30 ℃恒温培养箱中培养30 h，最后以十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.2.4 浓度对南瓜多糖体外抑菌效果的影响

用无菌水配制浓度为 200、100、50、25 mg/mL 以及12.5 mg/mL 的南瓜多糖溶液，采用牛津杯法检测并比较不同浓度的南瓜多糖对大肠杆菌O157：H7、金黄色葡萄球菌以及鲁氏接合酵母菌的抑菌圈大小。

1.2.5 温度对南瓜多糖体外抑菌效果的影响

将200 mg/mL 的南瓜多糖溶液分别置于37、60、80 ℃和100 ℃的恒温水浴中处理30 min，待冷却至室温后分别取100 μL 加入牛津杯中，做3 组重复并以无菌水作对照。以十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.2.6 pH 值对南瓜多糖体外抑菌效果的影响

用 1 mol/L HCl 溶液和 1 mol/L NaOH 溶液将200 mg/mL 的南瓜多糖溶液分别调成pH 值为2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0 的不同溶液，采用牛津杯法检测不同pH 值的南瓜多糖的体外抑菌效果。

1.2.7 最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的测定

根据均匀试验优化的结果处理南瓜多糖，之后用无菌水分别配制成浓度为 3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg/mL 的溶液，采用牛津杯法测定其对大肠杆菌O157：H7 和金黄色葡萄球菌的抑菌圈，以能出现抑菌圈的最低浓度作为最小抑菌浓度。

1.2.8 数据统计

用SPSS16.0 及Excel 软件进行单因素的方差分析以及均匀试验的回归分析，试验数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同浓度南瓜多糖的抑菌效果

不同浓度南瓜多糖的抑菌效果见表1。

如表1所示，南瓜多糖对革兰氏阴性菌大肠杆菌O157：H7 和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小随浓度的增加而逐渐增大，然而南瓜多糖即使浓度增加到200 mg/mL 仍对属于真菌的鲁氏接合酵母没有抑制作用。万艳娟等人报道南瓜多糖对属于革兰氏阴性菌的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有抑制作用，而对黄曲霉和黑曲霉这两种真菌没有抑制作用[7]。综合本文的结果与之前的报道可以推测，南瓜多糖对革兰氏阳性菌和阴性菌具有较好的抑制效果，而对真菌没有抑制作用。同一浓度下，南瓜多糖对金黄色葡萄球菌的抑制效果优于大肠杆菌O157：H7，这与郭奇等的报道一致[8]。当南瓜多糖的浓度增加到200 mg/mL 时，其对大肠杆菌O157：H7 和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别达到了9.53 mm 和9.68 mm。这一结果表明，南瓜多糖的浓度与其抑菌活性呈正相关，即南瓜多糖的浓度越大，其抑菌活性越强。

表1 不同浓度南瓜多糖的抑菌效果Table 1 The antibacterial effects of different concentrations of pumpkin polysaccharide

2.2 经不同温度处理的南瓜多糖的抑菌效果

南瓜多糖经不同温度处理后对大肠杆菌O157：H7 和金黄色葡萄球菌均表现出不同的抑制效果，说明温度会影响南瓜多糖的抑菌活性。南瓜多糖的这一性质与红薯茎叶多糖提取物和韭菜提取液相同[9-10]。

不同温度处理后的南瓜多糖的抑菌作用见图1。

图1 不同温度处理后的南瓜多糖的抑菌作用Fig.1 Antibacterial effects of pumpkin polysaccharides dealt with different temperatures

如图1所示，对大肠杆菌O157：H7 和金黄色葡萄球菌，当南瓜多糖在37 ℃和60 ℃的温度下处理后，其抑菌圈的大小变化不明显。当处理温度升高到80 ℃时，南瓜多糖能产生最大的抑菌圈，其直径分别可达9.78 mm 和9.84 mm，进一步将处理温度提高到100 ℃会使南瓜多糖产生的抑菌圈直径大幅度减少。这说明南瓜多糖的抑菌活性具有热稳定性，处理温度升高到一定程度会破坏南瓜多糖的结构，从而降低其抑菌效果，这一结论与Khan 等的研究结果相符[11]。

2.3 不同pH值的南瓜多糖的抑菌效果

南瓜多糖在 pH 值为 2.0、4.0、6.0、7.0、8.0 和 10.0时的抑菌活性结果如图2所示。

图2 不同pH值的南瓜多糖的抑菌作用Fig.2 Antibacterial effects of pumpkin polysaccharides with different pH values

在pH 值为6.0 的条件下，南瓜多糖对大肠杆菌O157：H7 和金黄色葡萄球菌的抑制作用均最强，其抑菌圈直径分别为9.66 mm 和9.88 mm。对于同种菌，当pH 值小于6 时，南瓜多糖的抑菌活性随着酸性的增强而减弱；当pH 值大于6 时，南瓜多糖的抑菌活性随着碱性的增强而减弱。南瓜多糖的这一性质与枸杞多糖和黄芪多糖相同，推测是由于在酸或碱条件下多糖的结构发生了变化，从而减弱了其自身的抑菌活性[12]。此外，在相同pH 值条件下，南瓜多糖对金黄色葡萄球菌的抑制效果优于大肠杆菌O157：H7，这与相同浓度下酸碱度呈中性的南瓜多糖对两种菌的抑制效果相同。

2.4 均匀试验因素水平设计

综合以上单因素试验结果，以抑菌圈直径作为检测指标，采用三因素六水平6 组试验的方式设计U6（63）均匀试验表考察南瓜多糖的浓度（X1）、处理温度（X2）以及pH 值（X3）对南瓜多糖体外抑菌活性的影响。U6（63）均匀试验设计因素水平表见表3。

表3 U6（63）均匀试验设计因素水平表Table 3 U6（63）table of uniform design

2.5 均匀试验结果

根据均匀试验表，在相应条件下分别进行体外抑菌试验，所得各组抑菌圈直径结果如表4所示。

表4 均匀试验结果Table 4 Results of uniform design

2.6 回归分析

以金黄色葡萄球菌为例，采用SPSS 软件和Excel对均匀试验结果进行分析[13]。先进行多元线性回归分析，得到复相关系数R=0.945，决定系数R2=0.892，方差分析显著性P=0.157＞0.05，说明多元线性回归模型不能显著地解释自变量与因变量之间的变化，需使用多元非线性回归模型进行回归分析。

经多元多项式回归分析，得到复相关系数R 及决定系数R2均为1.00，表明此回归模型能较好地揭示自变量与因变量之间的关系，确定方程为Y=9.16-0.18X2+0.02X2X3+0.000 034X12-0.005X32。在测试条件范围内，经过计算得到最佳优化条件为：南瓜多糖浓度200 mg/mL，温度100 ℃，pH 值为10 时，南瓜多糖对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，抑菌圈直径可达12.02 mm。经进一步试验验证，在此优化条件下得到的南瓜多糖对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为11.65 mm，与理论值相差0.37 mm，且远超过各试验值，说明均匀试验优化后的最优条件使南瓜多糖均有最强的抑菌活性。

2.7 南瓜多糖的最小抑菌浓度

将南瓜多糖配制成7 种不同浓度的溶液，调节其pH 值均为10，并在100 ℃恒温水浴中处理30 min，随后测定其抑菌效果，结果见表5。

表5 南瓜多糖的最小抑菌浓度Table 5 The minimal inhibitory concentration of pumpkin polysaccharide

南瓜多糖在浓度为12.5 mg/mL 时对大肠杆菌O157：H7 有抑制效果，而在浓度为6.25 mg/mL 时对大肠杆菌O157：H7 没有抑制作用。说明在试验浓度内，南瓜多糖对大肠杆菌O157：H7 的最小抑菌浓度为12.5 mg/mL。对于金黄色葡萄球菌，南瓜多糖在浓度为6.25 mg/mL 时有抑制作用，而在浓度降低到3.125 mg/mL时失去抑制效果，说明南瓜多糖对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为6.25 mg/mL。这些结果表明南瓜多糖对金黄色葡萄球菌的抑制效果较好，与抑菌圈试验结果相符。万艳娟等报道南瓜多糖对大肠杆菌的最小抑菌浓度为2 mg/mL[7]，与本试验结果不一致，分析可能存在以下原因：所选南瓜的品种有差别，南瓜多糖的提取方法存在差异。

3 结论

本试验以牛津杯法检测了南瓜多糖的体外抑菌活性。南瓜多糖对革兰氏阴性菌大肠杆菌O157：H7 以及革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌均具有明显的抑菌效果，而对真菌鲁氏接合酵母不具有抑制效果。不同条件处理得到的南瓜多糖具有不同的抑菌活性。南瓜多糖的抑菌活性与其浓度正相关，并在一定范围内随着处理温度的升高而升高，当温度达到80 ℃时抑菌活性达到最大。此外，酸性或碱性条件都会对南瓜多糖的抑菌活性产生影响。通过均匀试验优化，得到最佳的优化条件为：浓度 200 mg/mL，温度 100 ℃，pH 值为10。经此条件处理的南瓜多糖，体外抑菌活性最强。