不同方法提取鮟鱇鱼皮胶原蛋白的比较和分析

王锡念，徐志善，孙钦军，包建强，2，3，*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海 201306）

胶原蛋白是人体内分布最广的一种物质[1]，是细胞外基质的主要组成成分，在结缔组织、皮肤、骨骼等部位分布广泛[2]。胶原蛋白其分子中含有独特的三螺旋结构，所以具有强韧骨骼、保护血管、促进新陈代谢、增强免疫力等多重功效[3]。广泛应用在食品、药物传输系统、组织工程系统、生物医药等领域[1]。目前，胶原蛋白的提取方法主要有热水解法、酸法、碱法、酶解法[4]。其中，热提取法就是用一定温度的热水提取，获得水溶性胶原蛋白[5]，但是此方法提取的胶原蛋白其特有的三螺旋空间结构已被破坏，所得到的产物我们一般称之为明胶（gelatin）；酸法提取能最大程度地保持其三股螺旋结构，但产品得率较低；碱法迅速且彻底，但含羟基和巯基的氨基酸全部被破坏且产生消旋作用（结构变异）[6-7]，与其它提取方法相比碱法提取的胶原蛋白含量较少；酶解法较为常见，但其用时较长，提取率偏低。

超声波提取技术作为一种环境无污染技术[2]，具有空化作用，可以提高介质的传质速率和增强介质的质点运动，使得反应物质以均匀的小颗粒存在，最终使细胞组织破壁或变形，目标分子充分溶出，使提取时间缩短、纯度及提取率增加[8-9]。利用超声波提取节能、绿色等优点，辅助酶解法进行试验。超声波双酶法的研究较少，在鮟鱇鱼皮中的应用目前还未发现。在沈晗等[10]对酶解酱渣蛋白的研究中，采用响应面优化A、B 蛋白酶酶解酱渣蛋白的条件，水解度（degree of hydrolysis，DH）分别达到 7.67%、5.47%；在优化所得的超声预处理条件下再进行酶解，水解度分别提高至9.1%、8.54%，超声预处理效果显著，最终采取超声预处理A+B 步酶解，使水解度提高至较高水平的14.2%。在李侠等[11]对超声波-双酶法协同提取玉米须黄酮的研究中，超声波-双酶法协同提取玉米须黄酮提取率为（0.86±0.02）%，较单一超声波提取 [提取率（0.72±0.02）%]有明显提高。综上，超声波辅助双酶法提取的效果较为显著。

本研究拟以鮟鱇鱼加工的下脚料鱼皮为原料，采用超声波辅助双酶法（风味蛋白酶和碱性蛋白酶）和双酶法（风味蛋白酶和碱性蛋白酶）提取鮟鱇鱼皮中胶原蛋白，对两种方法提取的胶原蛋白提取率进行比较，旨在得出更好的提取方法，以期为工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鮟鱇鱼：舟山兴业有限公司；碱性蛋白酶（200 U/mg）、风味蛋白酶（20 000 U/g）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾：源叶生物科技有限公司；牛血清：国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯，试验用水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

T6 新世纪型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；歌能牌超声波清洗机、DHG-9070A 型鼓风干燥箱：上海鳌珍仪器制造有限公司；FOSS8400型全自动凯氏定氮仪：上海瑞玢国际贸易有限公司；Seven2Go 型 pH 计、ME204 型分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DK-S28 型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；H1850R 型高速冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼皮制备

取出冷冻鮟鱇鱼→流水化冻→将鱼皮剥下→分切成块→10%异丙醇浸泡24 h 去除脂肪，清水冲洗→10 %氯化钠溶液浸泡24 h 去除可溶性的非胶原蛋白[12]→清水冲洗→放入-50 ℃的冰箱备用。

1.3.2 鱼皮胶原蛋白的提取

取鮟鱇鱼皮流水解冻称取→加入定量提取溶剂、定量酶→超声→恒温水浴锅酶解→灭酶、冷却、离心→取上清液测鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 料液比单因素试验

以鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率为指标，采用超声-双酶法（风味蛋白酶和碱性蛋白酶）提取和双酶法提取进行对比，控制料液比为（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL），超声时间 60 min，pH7.5，酶解温度 45 ℃，酶解时间4 h，风味蛋白酶添加量4 000 U/g，碱性蛋白酶添加量4 000 U/g 进行试验。试验重复3 次，数据取均值。

1.3.3.2 超声时间单因素试验

以鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率为指标，采用超声-双酶法（风味蛋白酶和碱性蛋白酶）提取，控制料液比为 1∶15（g/mL），超声时间（40、50、60、70、80 min），pH7.5，酶解温度45 ℃，酶解时间4 h，风味蛋白酶添加量4 000 U/g，碱性蛋白酶添加量4 000 U/g 进行试验。试验重复3 次，数据取均值。

1.3.3.3 风味蛋白酶单因素试验

以鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率为指标，采用超声-双酶法（风味蛋白酶和碱性蛋白酶）提取和双酶法提取进行对比，控制料液比为 1∶15（g/mL），超声时间 60 min，pH7.5，酶解温度45 ℃，酶解时间4 h，风味蛋白酶添加量（2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g），碱性蛋白酶添加量4 000 U/g 进行试验。试验重复3 次，数据取均值。

1.3.3.4 碱性蛋白酶单因素试验。

以鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率为指标，采用超声-双酶法（风味蛋白酶和碱性蛋白酶）提取和双酶法提取进行对比，控制料液比为 1∶15（g/mL），超声时间60 min，pH7.5，酶解温度 45 ℃，酶解时间 4 h，风味蛋白酶添加量4 000 U/g，碱性蛋白酶添加量（2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g）进行试验。试验重复 3 次，数据取均值。

1.3.3.5 酶解时间单因素试验

以鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率为指标，采用超声-双酶法（风味蛋白酶和碱性蛋白酶）提取和双酶法提取进行对比，控制料液比为 1∶15（g/mL），超声时间60 min，pH7.5，酶解温度 45 ℃，酶解时间（2、3、4、5、6 h），风味蛋白酶添加量4 000 U/g，碱性蛋白酶添加量4 000 U/g 进行试验。试验重复3 次，数据取均值。

1.3.3.6 酶解温度单因素试验

以鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率为指标，采用超声-双酶法（风味蛋白酶和碱性蛋白酶）提取和双酶法提取进行对比，控制料液比为1∶15（g/mL），超声时间60 min，pH7.5，酶解温度（35、40、45、50、55 ℃），酶解时间4 h，风味蛋白酶添加量4 000 U/g，碱性蛋白酶添加量4 000 U/g 进行试验。试验重复3 次，数据取均值。

1.3.3.7 pH 值单因素试验

以鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率为指标，采用超声-双酶法（风味蛋白酶和碱性蛋白酶）提取和双酶法提取进行对比，控制料液比为1∶15（g/mL），超声时间60 min，pH（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5），酶解温度 45 ℃，酶解时间4 h，风味蛋白酶添加量4 000 U/g，碱性蛋白酶添加量4 000 U/g 进行试验。试验重复3 次，数据取均值。

1.3.4 正交试验

1.3.4.1 超声-双酶法正交试验

在单因素的基础上，选出以下5个因素进行正交试验。以风味蛋白酶添加量、碱性蛋白酶添加量、超声时间、酶解时间和酶解温度为考察因素，各选取4个水平，采用L16（45）试验设计，以鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率为评价指标，确定最佳提取工艺，试验因素及水平见表1。

表1 超声-双酶法提取鮟鱇鱼皮胶原蛋白因素水平表Table 1 Extraction of collagen from fish skin by ultrasonic double enzyme method

1.3.4.2 双酶法正交试验

在单因素的基础上，选出以下4个因素进行正交试验。以风味蛋白酶添加量、碱性蛋白酶添加量、酶解温度和pH 值为考察因素，各选取3个水平，采用L9（34）试验设计，以鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率为评价指标，确定最佳提取工艺，试验因素及水平见表2。

表2 双酶法提取鮟鱇鱼皮胶原蛋白因素水平表Table 2 Extraction of collagen from fish skin by double enzyme method

1.4 胶原蛋白提取率的测定

1.4.1 水分含量的测定

鮟鱇鱼皮水分含量的测定[13]：采用GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》直接干燥法。

1.4.2 蛋白质含量的测定

鮟鱇鱼皮蛋白质含量的测定[14]：采用GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》凯氏定氮。

1.4.3 胶原蛋白提取率的计算

通过测定羟脯氨酸含量来计算胶原蛋白提取率，羟脯氨酸的测定参照GB/T 9695.23-2008《肉与肉制品羟脯氨酸含量测定》[15]。羟脯氨酸标准样品的回归方程：y=0.224 4x-0.000 6（R2=0.999 97）。鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率以干基表示[16]。

式中：X 为鮟鱇鱼皮胶原蛋白提取率，%；w 为羟脯氨酸含量，g；11.1 为羟脯氨酸转为胶原蛋白的系数；m为鮟鱇鱼皮蛋白质含量，g；k 为鮟鱇鱼皮水分含量，%。

1.5 数据处理

采用Origin 8.5 和SPSS 24.0 进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对胶原蛋白提取率的影响

料液比对胶原蛋白提取率的影响见图1。

图1 料液比对胶原蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of material and liquid ratio on the extraction rate of collagen

从图1得出，超声-双酶法胶原蛋白提取率高于双酶法。对于超声-双酶法，料液比在1∶5（g/mL）至1∶10（g/mL）时，胶原蛋白提取率呈现上升的趋势，当料液比在1∶10（g/mL）时胶原蛋白提取率最大，之后提取率呈下降趋势，说明当液料比值达到一定程度时，鱼皮组织已经达到足够疏松状态，继续增大液料比值，使酶的浓度降低，其与底物不能达到最佳作用点；双酶法，料液比在1∶15（g/mL）时，胶原蛋白的提取率最大。因此，超声-双酶法选择料液比 1∶10（g/mL），双酶法选择料液比 1∶15（g/mL）。

2.1.2 超声时间对胶原蛋白提取率的影响

超声时间对胶原蛋白提取率的影响见图2。

从图2得出，超声-双酶法在超声时间40 min～60 min 时，胶原蛋白提取率呈上升的趋势，随着超声时间的增加，样品的破碎程度增加，因此与酶的作用更加充分，超声时间在60 min 时，提取率最高，超声时间在60 min～80 min 时，提取率下降，这是因为超过时间越长，可能会使提取样品溶液的温度升高，使得酶的活力降低甚至失活，并且部分胶原蛋白分子结构可能被破坏或者发生热降解，使胶原蛋白提取率下降[17]，因此，选择超声时间60 min。

2.1.3 风味蛋白酶添加量对胶原蛋白提取率的影响

风味蛋白酶添加量对胶原蛋白提取率的影响见图3。

图2 超声时间对胶原蛋白提取率的影响Fig.2 The effect of ultrasonic time on the extraction rate of collagen

图3 风味蛋白酶添加量对胶原蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of flavor protease addition on extraction rate of collagen protein

如图3得出，超声-双酶法胶原蛋白提取率高于双酶法。风味蛋白酶添加量在2 000 U/g～4 000 U/g 时，超声-双酶法和双酶法胶原蛋白提取率增加，在4 000 U/g时，胶原蛋白提取率最大，在4 000 U/g～6 000 U/g 时，胶原蛋白提取率下降。随着酶添加量的增多，反应速率加快，当酶的添加量到一定浓度时，反应速率不变，说明酶与底物反应充分，此时反应速率与酶添加量无关，产物浓度的增大对提取率会有一定的抑制作用[17]。因此，选择风味蛋白酶添加量为4 000 U/g。

2.1.4 碱性蛋白酶添加量对胶原蛋白提取率的影响

碱性蛋白酶添加量对胶原蛋白提取率的影响见图4。

图4 碱性蛋白酶添加量对胶原蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of alkaline protease addition on extraction rate of collagen protein

如图4得出，超声-双酶法胶原蛋白提取率高于双酶法。在超声时间60 min，pH7.5，酶解温度45 ℃，酶解时间4 h，风味蛋白酶添加量4 000 U/g，碱性蛋白酶添加量在2 000 U/g～4 000 U/g 时，超声-双酶法和双酶法胶原蛋白提取率增加，在4 000 U/g 时，胶原蛋白提取率最大，4 000 U/g～6 000 U/g 时，胶原蛋白提取率下降。随着碱性蛋白酶添加量的增加，反应速率加快，底物质量浓度进一步增大，酶的活性中心逐渐被底物所饱和时，增加底物质量浓度提取率也不会增加，反而影响反应速度，使提取率降低[18]。因此，选择碱性蛋白酶添加量4 000 U/g。

2.1.5 酶解时间对胶原蛋白提取率的影响

酶解时间对胶原蛋白提取率的影响见图5。

图5 酶解时间对胶原蛋白提取率的影响Fig.5 The effect of enzymolysis time on the extraction rate of collagen

如图5得出，超声-双酶法的胶原蛋白提取率高于双酶法。随着酶解时间的增加，胶原蛋白的提取率也随之增加，超声-双酶法在5 h 时提取率最高，在5 h以后提取率下降，而双酶法在4 h 时提取率最高，在4 h 以后提取率下降。随着时间的增加酶与底物的反应速率也随之加快，使提取率增加，在一个最适的酶解时间使提取率最高，超过最适酶解时间后，部分胶原蛋白水解，提取率下降[17]。因此，超声-双酶法选择酶解时间5 h，双酶法选择酶解时间4 h。

2.1.6 酶解温度对胶原蛋白提取率的影响

酶解温度对胶原蛋白提取率的影响见图6。

图6 酶解温度对胶原蛋白提取率的影响Fig.6 The effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of collagen

如图6得出，超声-双酶法的胶原蛋白提取率高于双酶法。随着酶解温度升高，胶原蛋白提取率升高，超声-双酶法在酶解温度45 ℃时提取率最大，在45 ℃之后提取率下降，而双酶法在50 ℃时提取率最高，在50 ℃之后提取率下降。随着温度的升高酶的最适温度逐渐达到，使提取率升高，当达到最适温度并且酶与底物作用完全时提取率最大，之后温度继续升高，使酶的活力降低提取率开始下降。在超声的作用下，使得反应物质以均匀的小颗粒存在，与酶反应更快且充分[8]，所以超声-双酶法在比双酶法更低的温度下使胶原蛋白提取率达到最大。因此，超声-双酶法选择酶解温度45 ℃。

2.1.7 pH 值对胶原蛋白提取率的影响

pH 值对胶原蛋白提取率的影响见图7。

图7 pH值对胶原蛋白提取率的影响Fig.7 Effect of pH on collagen extraction rate

如图7得出，超声-双酶法的胶原蛋白提取率高于双酶法。随着pH 值的增大，胶原蛋白提取率增大，超声-双酶法和双酶法在pH7.0 时提取率最大，在pH7.0 之后提取率下降。随着pH 值的增大提取率增大，且酶逐渐达到最适pH 值，使提取率达到最大，pH值过大后会使酶的活性降低，提取率下降。因此，超声-双酶法选择pH7.0。

2.2 正交试验结果

2.2.1 超声-双酶法

根据单因素试验结果得出各因素对提取率的影响，确定正交试验水平，正交试验结果见表3。

表3 超声-双酶法提取胶原蛋白正交试验结果Table 3 Orthogonal test results of ultrasonic double enzyme extraction of collagen protein

由表3得出各因素对胶原蛋白提取率影响大小：酶解温度＞碱性蛋白酶添加量＞超声时间＞风味蛋白酶添加量＞酶解时间。最佳提取条件为：A2B4C4D3E3，即风味蛋白酶添加量3 000 U/g，碱性蛋白酶添加量5 000 U/g，超声时间70 min，酶解时间5 h，酶解温度50 ℃。对所得的优化条件进行验证试验，在1∶15（g/mL），风味蛋白酶添加量3 000 U/g，碱性蛋白酶添加量5 000 U/g，超声时间 70 min，酶解温度 50 ℃，酶解时间 5 h，pH7.5 的条件下进行试验，胶原蛋白提取率为（8.86±0.64）%。超声-双酶法提取胶原蛋白方差分析表见表4。

表4 超声-双酶法提取胶原蛋白方差分析表Table 4 Analysis of variance of collagen extracted by ultrasonic double enzyme method

由表4超声-双酶法提取胶原蛋白方差分析表得出，超声时间对胶原蛋白提取率差异性显著，其余4个因素对胶原蛋白提取率差异性极显著。

2.2.2 双酶法

根据单因素试验结果得出各因素对提取率的影响，确定正交试验水平，正交试验结果见表5。

表5 双酶法提取胶原蛋白正交试验结果Table 5 Orthogonal test results of double enzyme extraction of collagen

由表5得出各因素对胶原蛋白提取率影响大小：酶解温度＞风味蛋白酶添加量＞pH 值＞碱性蛋白酶添加量。最佳提取条件为：A3B3C3D3，即风味蛋白酶添加量5 000 U/g，碱性蛋白酶添加量5 000 U/g，酶解温度55 ℃，pH8.0。对所得的优化条件进行验证试验，在料液比 1∶15（g/mL），风味蛋白酶添加量 5 000 U/g，碱性蛋白酶添加量5 000 U/g，酶解温度55 ℃，酶解时间4 h，pH8.0 的条件下进行试验，胶原蛋白提取率为（4.55±0.20）%。双酶法提取胶原蛋白方差分析表见表6。

由图6双酶法提取胶原蛋白方差分析表得出，风味蛋白酶添加量和酶解温度对胶原蛋白提取率差异性显著，酶解时间和pH 值对胶原蛋白提取率差异性不显著。

表6 双酶法提取胶原蛋白方差分析表Table 6 Analysis of variance of collagen extracted by double enzyme method

2.3 超声-双酶法与双酶法的比较与分析

两种提取方法的结果比较见表7。

表7 两种提取方法的结果比较Table 7 Comparison of the results of two extraction methods

从表7可以得出，超声-双酶法提取胶原蛋白提取率为（8.86±0.64）%，双酶法提取胶原蛋白提取率为（4.55±0.20）%。双酶法中风味蛋白酶添加量比超声-双酶法多用2 000 U/g，且双酶法中胶原蛋白提取率比超声-双酶法低4.31%，也就是超声-双酶法的胶原蛋白提取率更高。因此，超声-双酶法提取胶原蛋白的效果更佳。

3 结论

采用超声-双酶法提取胶原蛋白并对工艺进行优化。结果显示，影响胶原蛋白的主次因素为：酶解温度＞碱性蛋白酶添加量＞超声时间＞风味蛋白酶添加量＞酶解时间。最佳提取条件为：A2B4C4D3E3，即风味蛋白酶添加量3 000 U/g，碱性蛋白酶添加量5 000 U/g，超声时间70 min，酶解时间5 h，酶解温度50 ℃。在此条件下得到的胶原蛋白提取率为（8.86±0.64）%。双酶法提取胶原蛋白的最佳提取条件为：风味蛋白酶添加量5 000 U/g，碱性蛋白酶添加量5 000 U/g，酶解温度55 ℃，pH8.0。在此条件下得到胶原蛋白提取率为（4.55±0.20）%。通过超声-双酶法与双酶法提取胶原蛋白的最佳提取条件及胶原蛋白提取率对比，得出双酶法中风味蛋白酶添加量比超声-双酶法多用2 000 U/g，且双酶法中胶原蛋白提取率比超声-双酶法低4.31%。采用超声-双酶法提取有利于样品细化及提取，且效率高，说明超声-双酶法提取胶原蛋白的效果更好。通过这种方式解决了废鱼皮浪费问题，为废鱼皮精深加工提供理论基础，还为鮟鱇鱼皮胶原蛋白在食品加工中的应用提供科学依据。