4种农药复合污染对斑马鱼仔鱼联合毒性效应

郭东梅，李耘，邱静，许彦阳，杨桂玲，王强， 钱永忠,*

1. 浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州 310021 2. 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081

农药在防治农作物病、虫和草害、促进农作物生长和保证增产增收方面起了积极作用。但是大量使用的农药可以通过雨水冲刷等不同的途径进入水体，污染水资源，给水生生态系统和人类健康造成严重影响[1-3]。氯氰菊酯被广泛用于防治棉花、水果和蔬菜等的多种害虫[4-5]。氯氰菊酯虽然在土壤中有较高的疏水性和较高的稳定性，但是它很容易通过径流和土壤侵蚀运输到水生态系统中[6-7]。马拉硫磷是一种常用的有机磷类杀虫剂，用以防治水果、蔬菜上的主要虫害[8-9]。杀螟硫磷具有神经毒性，可抑制胆碱酯酶和刺激神经系统[10]。咪鲜胺是一类被广泛应用的咪唑类杀菌剂，能够抑制麦角甾醇生物合成[11-15]。在水生态环境中，农药往往是以复合污染物的形式存在。氯氰菊酯、马拉硫磷、杀螟硫磷和咪鲜胺等大量使用，其残留污染在水生环境中时常被检测到[16-17]，且经常共存于水体中。

斑马鱼个体小，繁殖周期短，胚胎透明便于观察，与人类基因同源性高达87%以上，因此，在毒理学研究中常作为模式生物。目前，关注单一污染物毒性作用的研究较多，而探究污染物联合毒性效应的相对较少[18]。笔者以斑马鱼仔鱼为模式生物，研究了氯氰菊酯、马拉硫磷、杀螟硫磷和咪鲜胺对斑马鱼仔鱼的急性毒性，以及4种农药的二元、三元和多元复合污染对斑马鱼仔鱼的联合毒性效应，以期为复合污染的生态毒理学评估提供一定的毒理学数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器和试剂

24孔细胞培养板(浙江拱东医疗科技有限公司)；光照培养箱(三洋MLR-350HT)；体视显微镜(Leica L2型)。

95%氯氰菊酯乳油、97%咪鲜胺粉剂和95%马拉硫磷乳油由南京红太阳有限公司生产；95%杀螟硫磷乳油由台州黄岩永宁农药化工有限公司生产；纯度为99%的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)由天津市福晨化学试剂厂生产；纯吐温-80由国药集团化学试剂有限公司生产。

氯氰菊酯、马拉硫磷、杀螟硫磷和咪鲜胺原药用吐温-80和DMF溶解，经超声混匀定容配制为10 000 μg·L-1的母液，放在-4 ℃冰箱中备用。

1.2 实验材料

斑马鱼AB品系购买于武汉中国科学院水生生物研究所国家斑马鱼资源中心。斑马鱼分别在每天早、中和晚喂食新孵化的丰年虾。鱼饲养在活性炭过滤并充分曝气的水循环系统中，水温为(26±1) ℃，pH为8.34，光/暗比为14 h∶10 h，总硬度为28～32 DH。本试验所用斑马鱼仔鱼为种鱼繁殖所得。在倒置显微镜下挑选各脏器都已形成、无异常受精后6日龄的仔鱼进行毒性试验。

1.3 试验方法

1.3.1 单一农药对斑马鱼仔鱼染毒试验

参考OECD TG 203[19]方法，将氯氰菊酯、马拉硫磷、杀螟硫磷和咪鲜胺母液分别用实验室的曝氧水以1.5倍浓度梯度间隔稀释成一系列梯度溶液。采用24孔细胞培养板，每孔加入2.5 mL测试溶液，并移入一个发育正常的仔鱼。以稀释水为空白对照组，1个24孔板为1个重复，每个浓度设3次重复。为了防止溶液挥发，测试的24孔细胞培养板用胶带密封。

染毒期间，仔鱼放入温度为(26±1) ℃、光/暗比为14 h∶10 h的恒温培养箱中。在染毒试验期间，仔鱼不被喂养。为了确保试验期间药剂浓度不变，每隔24 h更换药液一次，并于染毒后的24、48、72和96 h观察仔鱼死亡数。在显微镜下观察，仔鱼无心跳被判断为死亡(OECD, 1998)[20]。

1.3.2 农药混合污染对斑马鱼仔鱼染毒试验

氯氰菊酯、马拉硫磷、杀螟硫磷和咪鲜胺的二元、三元及多元混合污染对斑马鱼仔鱼的联合毒性测试，依据单一农药对斑马鱼仔鱼96 h-LC50值为一个毒性单位，按照等毒比(1∶1)进行混合配制。混合农药用实验室的曝氧水以1.5倍浓度梯度间隔稀释成一系列梯度溶液，试验具体方法同1.3.1部分。

1.3.3 数据处理

根据斑马鱼仔鱼在一定浓度下的死亡数，利用DPS软件计算农药的毒力回归方程，并确定农药的LC50值及其95%置信限。

采用Marking相加指数法[21]来判定农药的联合毒性。生物毒性作用之和(S)计算公式为S=Am/Ai+Bm/Bi+Cm/Ci，式中：Am、Bm和Cm分别为混合物中各毒物的LC50；Ai、Bi和Ci分别为A、B和C毒物单独作用时的LC50。

将S转换成相加指数(additive index, AI)。当S≤1时，AI=(1/S)-1.0；当S>1时，AI=1.0-S。当AI=0时为相加作用；当AI>0时为大于相加作用，即协同作用；当AI<0时为小于相加作用，即拮抗作用。

2 结果(Results)

2.1 单一农药对斑马鱼仔鱼的毒性效应

表1列出了单一农药氯氰菊酯、杀螟硫磷、马拉硫磷和咪鲜胺对斑马鱼仔鱼的LC50值。在染毒24、48、72和96 h时，4种农药对仔鱼的致死作用都存在一定的时间-剂量效应关系，并且每种农药的LC50值随着暴露时间的延长呈逐渐降低的趋势。氯氰菊酯对斑马鱼仔鱼的毒性最高，属于高等毒性，其96 h-LC50值为0.12 mg·L-1。马拉硫磷对斑马鱼仔鱼的毒性最低，属于低等毒性，其96 h-LC50值为17.88 mg·L-1。在96 h时，氯氰菊酯对斑马鱼仔鱼的毒性是马拉硫磷毒性的149倍。各污染物对斑马鱼仔鱼毒性次序为氯氰菊酯>咪鲜胺>杀螟硫磷>马拉硫磷。

2.2 二元及多元农药混合污染对斑马鱼仔鱼毒性效应

氯氰菊酯、杀螟硫磷、马拉硫磷和咪鲜胺的二元及多元混合污染联合毒性效应如表2～表7所示。根据单一农药对斑马鱼仔鱼96 h-LC50的值，采用等毒性配比(1∶1)研究了二元、三元和多元农药复合污染对斑马鱼仔鱼的联合毒性效应。在染毒24、48、72和96 h时，二元农药混合污染(氯氰菊酯+马拉硫磷；氯氰菊酯+杀螟硫磷和氯氰菊酯+咪鲜胺)对斑马鱼仔鱼的联合毒性均表现为协同作用。氯氰菊酯+马拉硫磷二元联合暴露对斑马鱼仔鱼在24、48、72和96 h的联合毒性相加指数分别为3.10、2.13、2.09和1.96，然而随着暴露时间的延长这种协同作用逐渐减弱。

杀螟硫磷+咪鲜胺二元农药混合污染对斑马鱼仔鱼在24、48、72和96 h的联合毒性相加指数分别为0.89、1.13、1.86和2.03，联合毒性作用表现为协同作用，并且随着暴露时间的延长协同作用增强。杀螟硫磷+马拉硫磷对斑马鱼仔鱼的二元联合暴露在24、48、72和96 h的相加指数分别为0.27、0.06、0.05和0.12，这2种农药的联合暴露对斑马鱼仔鱼在24 h的联合毒性表现为协同作用，在48、72和96 h时联合毒性表现为相加作用。马拉硫磷+咪鲜胺二元农药对斑马鱼仔鱼在24、48、72和96 h的联合毒性相加指数分别为-1.19、-1.38、-1.86和-1.14，联合毒性作用表现为拮抗作用。

表2 氯氰菊酯、马拉硫磷和杀螟硫磷对斑马鱼仔鱼联合毒性Table 2 The joint toxicity of cypermethrin, malathion and fenitrothion to zebrafish larvae

表3 氯氰菊酯、咪鲜胺和马拉硫磷对斑马鱼仔鱼联合毒性Table 3 The joint toxicity of cypermethrin, prochloraz and malathion to zebrafish larvae

表4 马拉硫磷、杀螟硫磷和咪鲜胺对斑马鱼仔鱼联合毒性Table 4 The joint toxicity of malathion, fenitrothion and prochloraz to zebrafish larvae

表5 氯氰菊酯、马拉硫磷、杀螟硫磷和咪鲜胺混合污染对斑马鱼仔鱼联合毒性Table 5 The joint toxicity of cypermethrin, malathion, fenitrothion and prochloraz to zebrafish larvae

表6 马拉硫磷、杀螟硫磷、咪鲜胺和氯氰菊酯混合污染对斑马鱼仔鱼联合毒性Table 6 The joint toxicity of malathion, fenitrothion, pochloraz and cypermethrin to zebrafish larvae

表7 四元农药混合污染对斑马鱼仔鱼联合毒性Table 7 The joint toxicity of quaternary pesticide to zebrafish larvae

三元农药氯氰菊酯+马拉硫磷+杀螟硫磷对斑马鱼仔鱼在24、48、72和96 h的联合毒性相加指数分别为6.52、3.69、5.54和4.71，联合毒性表现为协同作用；氯氰菊酯+马拉硫磷+咪鲜胺对斑马鱼仔鱼在24、48、72和96 h的联合毒性相加指数分别为4.56、3.35、2.85和2.33，联合毒性表现为协同作用，随着暴露时间的延长这种协同作用逐渐减弱。马拉硫磷+杀螟硫磷+咪鲜胺对斑马鱼仔鱼在24、48、72和96 h的联合毒性相加指数分别为2.57、2.45、2.23和2.03，联合毒性表现为协同作用，随着暴露时间的延长这种协同作用逐渐减弱。咪鲜胺+氯氰菊酯+杀螟硫磷对斑马鱼仔鱼在24、48、72和96 h的联合毒性相加指数分别为3.17、4.26、6.14和2.84，联合毒性表现为协同作用。氯氰菊酯+马拉硫磷+杀螟硫磷+咪鲜胺四元农药复合污染对斑马鱼仔鱼在24、48、72和96 h的相加指数分别为3.55、3.76、3.55和3.35，联合毒性均表现为协同作用。

3 讨论(Discussion)

斑马鱼的不同生命阶段(胚胎、仔鱼、幼鱼和成鱼)均可以用来开展毒理学研究，但斑马鱼早期生命阶段(胚胎和仔鱼)对污染物的敏感性要高于其他生命阶段(成年和幼鱼)[22]。本研究中，斑马鱼仔鱼在染毒24、48、72和96 h时，各污染物对斑马鱼毒性次序为氯氰菊酯>咪鲜胺>杀螟硫磷>马拉硫磷。Bradbury和Coats[23]报道了在相同浓度下，拟除虫菊酯类农药对鱼的毒性是对哺乳动物和鸟类的约1 000倍。拟除虫菊酯类农药氯氰菊酯对鱼类具有高毒性，一方面是由于鱼鳃对农药有较高的吸收率和缓慢的水解率，另一方面是鱼的神经系统对这些农药有超敏感性[24]。

在真实的生态环境中，农药污染物并不是以单体的形式存在，而是以混合污染物形式共同存在，较多的研究主要集中在单一污染物毒理效应方面[25]。采用单一污染物进行的毒性研究可能低估在复杂的混合污染环境中的毒性效应，混合污染物可能产生复杂的联合毒性效应[26]。在本研究中，氯氰菊酯和有机磷类农药复合污染(氯氰菊酯+马拉硫磷、氯氰菊酯+杀螟硫磷)比其他几种二元农药的联合作用表现出更强烈的协同作用，可能是由于有机磷类农药和拟除虫菊酯类农药混合共存时，有机磷类农药能与单加氧酶结合，导致分子的活化通过与单加氧酶结合，防止了拟除虫菊酯类农药的降解。二元农药混合污染(氯氰菊酯+杀螟硫磷、氯氰菊酯+马拉硫磷、氯氰菊酯+咪鲜胺和杀螟硫磷+咪鲜胺)对斑马鱼仔鱼联合作用也均表现为协同作用。在水生态系统中这些污染物共同存在时，污染物对水生生物的毒性效应可能增加。Liu等[27]开展了西草净、除草定、环嗪酮、多果定、甲霜灵和残杀威等6种农药的二元复合污染对小球藻和发光细菌的毒性研究，采用浓度相加(CA)模型作为参考模型，8种二元农药混合污染对发光细菌联合作用表现协同作用，4种二元农药混合污染对小球藻联合作用表现为拮抗作用。也有研究表明，灭多威和辛硫磷对罗非鱼的联合毒性作用表现为协同作用[28]。

在笔者的研究中，所有三元农药(氯氰菊酯+马拉硫磷+杀螟硫磷、氯氰菊酯+马拉硫磷+咪鲜胺、马拉硫磷+杀螟硫磷+咪鲜胺和咪鲜胺+氯氰菊酯+杀螟硫磷)和四元农药(氯氰菊酯+马拉硫磷+杀螟硫磷+咪鲜胺)混合污染对斑马鱼仔鱼联合作用均表现为协同作用。Wang等[29]研究了氯氟氰菊酯、毒死蜱和辛硫磷3种杀虫剂和乙草胺的多元混合污染对陆栖生物蚯蚓的联合毒性，结果表明，大多数三元和四元农药混合暴露对蚯蚓的联合毒性作用均表现协同作用。在真实的生态环境中，农药复合污染的联合毒性作用不仅与污染物的组成和浓度有关，还与测试系统和染毒时间等多种因素有关，可以说是一个很复杂的问题。当多种农药残留污染共同时，对水生生物可能产生复杂的联合毒性效应，因此，未来研究中应更多关注混合污染物的生态毒理效应和风险评估。