异菌脲在土壤中的降解和移动性研究

程冰峰，杨倩文，束兆林，缪康，王鸣华,*

1. 南京农业大学植物保护学院，南京 210095 2. 江苏省绿盾植保农药实验有限公司，句容 212400

农药在使用后会直接或间接地进入土壤、水体和空气等介质中。而农药进入土壤后，不仅对土壤生物(土壤微生物、蚯蚓等)会有一定的影响[1]，也可通过淋溶作用使农药进入地下水，造成地下水污染，而且也可以通过生物富集作用最终进入人体，影响人类身体健康[2-3]。农药在土壤中的残留降解特性，对农药的合理使用和环境安全性具有重要指导意义，它除了与农药本身的特性有关外，也与土壤环境(如含水量、有机质、黏土含量和pH等)有关[4]。农药在土壤中的迁移性与农药的水溶性、吸附性和降解性等因素密切相关，是评价农药对地下水生态环境安全性的重要指标[5-6]。

异菌脲(iprodione)，又名扑海因，化学名称3-(3,5-二氯苯基)-1-异丙基氨基甲酰基乙内酰脲，是安万特作物科学公司(Aventis Co., Ltd.)开发生产的二甲酰亚胺类高效广谱、保护型杀菌剂。适用于防治多种果树、蔬菜和瓜果类等作物早期落叶病、灰霉病和早疫病等病害。结构式如图1所示。

目前，国内研究主要集中于探究异菌脲在油菜[7]、苹果[8]、草莓[9]、黄瓜[10]、番茄[11]等蔬菜和水果中的消解动态和残留量的测试方法，也有研究毒死蜱、三唑酮和功夫菊酯3种农药对异菌脲光化学降解的影响[12]。国外也有不少对异菌脲在作物上残留量的检测[13-14]；Mercadier等[15]和Campos等[16]研究了土壤微生物对土壤中异菌脲降解的影响以及降解机理；Wang等[17]研究了异菌脲对土壤细菌群落的影响。关于异菌脲在土壤中的降解和迁移的研究尚未见报道。本文通过室内模拟方法，研究异菌脲在土壤中的降解及移动性，为异菌脲合理使用以及土壤环境和地下水安全性评价提供理论依据。

图1 异菌脲的化学结构式Fig. 1 Chemical structure of iprodione

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

异菌脲标准品(质量分数99.5%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)；色谱乙腈(美国TEDIA公司)；乙腈(分析纯，天津科密欧化学试剂公司)；无水硫酸镁、无水硫酸钠和氯化钠(均为分析纯，广西西陇化工股份有限公司)。

Agilent 1260高效液相色谱仪(UV检测器，美国Agilent科技有限公司)；HWS智能恒温培养箱(宁波江南仪器厂)；TH-3560全自动高压灭菌锅(造鑫企业有限公司)；R-3旋转蒸发器(瑞士Buchi公司)；JN25-12D超声波清洗机(宁波江南仪器厂)；TDL-40B台式离心机(上海安亭仪器有限公司)；涡旋混合仪(桂宁(上海)实验器材有限公司)。

供试土壤为东北黑土、江西红壤、南京黄棕壤和青海草甸土，这4种土壤均采自农田耕作层土壤，土壤样品的理化性质如表1所示。

表1 供试土壤的理化性质Table 1 The physico-chemical properties of the tested soils

1.2 分析条件

色谱柱为Poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×150 mm，4 μm)；流动相为V(乙腈)∶V(水)=60∶40；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为208 nm；柱温为30 ℃；进样量为20 μL。在此条件下，异菌脲保留时间为5.9 min。

用流动相将异菌脲标准溶液(乙腈为溶剂，浓度1 000 mg·L-1)梯度稀释配制成质量浓度分别为0.05、0.1、1.0、5.0和10.0 mg·L-1的异菌脲标准工作溶液，在上述HPLC条件下进行测定，以异菌脲峰面积为纵坐标(y)，异菌脲质量浓度为横坐标(x)绘制标准曲线，所得线性回归方程为y=161.56x-6.8，R2=0.9999。

1.3 样品中异菌脲的提取

水样：取待测水样过0.22 μm滤膜，HPLC测定样品中异菌脲含量。

土壤样品：称取20 g土壤于100 mL离心管中，加入5 mL水和40 mL乙腈，涡旋5 min，超声10 min，加入3 g NaCl和4 g无水硫酸镁，涡旋5 min，以4 000 r·min-1离心5 min，取15 mL上清液，过无水硫酸钠干燥，旋转浓缩近干，2 mL流动相溶解定容，过0.22 μm滤膜，HPLC测定样品中异菌脲的含量。

在空白水样和土壤样品中添加异菌脲标样使其添加浓度为0.02、0.2和2.0 mg·kg-1，回收率分别为96.53%～101.29%和88.62%～102.39%，相对标准偏差分别为0.27%～1.42%和1.81%～4.34%。方法的准确度和精密度均符合检测要求。

1.4 异菌脲土壤降解试验

1.4.1 土壤样品制备

预培养土壤：分别称取上述4种土壤于250 mL三角瓶中，加水至土壤饱和持水量的40%，用棉塞将瓶口塞紧，置于人工气候箱中恒温(25 ℃)恒湿(75%)预培养2周。阴干、粉碎和过筛后备用。

灭菌土壤的制备：将过20目筛的南京黄棕壤置于121 ℃、1.1 atm高压灭菌锅内持续灭菌30 min，将灭菌的土壤样品置于恒温培养箱内培养，24 h后再重复灭菌1次。

去有机质土壤的制备：将过20目筛的南京黄棕壤置于1 000 mL烧杯中，加入少量去离子水润湿，加入50 mL 体积比为30%的双氧水溶液，用玻璃棒不断搅拌以使氧化速率加快。待烧杯和土壤稍冷片刻后，重复上述过程，直至土壤中的有机质全部被氧化。将烧杯放于通风处静置，弃掉上层液体，将去有机质土样晾干、过筛。

灭菌去有机质土壤的制备：将去有机质土壤按上述方法进行灭菌处理。

1.4.2 异菌脲在不同类型土壤中的降解

分别称取20.0 g预培养的东北黑土、江西红壤、青海草甸土和南京黄棕壤样品若干份，分别置于250 mL锥形瓶中。加入异菌脲-丙酮标准溶液，使土壤中异菌脲的浓度为2 mg·kg-1，调节土壤湿度至饱和持水量的60%，置于(25±1) ℃恒温培养箱内黑暗培养。定期称重补充水分。于培养后不同时间取样，HPLC检测土壤中异菌脲含量。每个处理设3次重复。

1.4.3 土壤含水量和厌氧条件对异菌脲降解的影响

以南京黄棕壤为供试土壤，调节土壤含水量为10%、20%、30%、40%和渍水条件，其他条件与异菌脲不同类型土壤中的降解试验一致。

1.4.4 异菌脲在灭菌和去有机质(灭菌)土壤中的降解

分别称取灭菌、去除有机质土壤以及灭菌去有机质土壤20.0 g若干份于250 mL三角瓶中，用未处理的南京黄棕壤作为对照，其他条件与异菌脲在不同类型土壤中的降解试验一致。

1.5 异菌脲在土壤中的移动性测定

分别称取经风干、研磨和过筛(60目)的南京黄棕壤、江西红壤、东北黑土和青海草甸土样品10.0 g于烧杯中加水8 mL搅拌，直至成均匀的泥浆状，用玻璃棒将泥浆均匀涂布于7 cm×20 cm玻璃层析板上，土层厚度约0.7 mm，玻璃层析板在室温下阴干后，于距玻璃层析板底部1.5 cm处逐滴点上异菌脲-丙酮溶液，点药量为10.0 μg。待溶剂挥发后放在以水作为展开剂的层析槽内，薄板倾斜角度约为30°，板下端淹水0.5 cm，于25 ℃下进行薄层层析实验。当展开剂到达距薄板前沿2 cm处时，取出薄板置于室温下避光晾干，将土壤薄层等分为6段，分别测定各段土壤中异菌脲的质量浓度。每个处理设3次重复。

1.6 异菌脲在土壤中淋溶性测定

分别称取450 g风干、过筛(20目)的4种供试土壤样品，加0.01 mol·L-1CaCl2溶液至土壤饱和持水量的60%，装于内径5 cm，柱长35 cm的PVC塑料管中，制成30 cm高的土柱，在上端添加1 cm厚的石英砂，将0.5 mg异菌脲的丙酮溶液均匀滴加在石英砂表面，用蠕动泵以30 mL·h-1的速度用300 mL 0.01 mol·L-1CaCl2溶液淋洗土柱，淋洗完毕后，将土柱均匀分成3段，分别测定各段土柱及淋出液中异菌脲的含量。

1.7 数据处理

土壤降解：农药在土壤中的降解一般用一级动力学方程描述，土壤降解动力学方程和降解半衰期分别按下式计算。

ct=c0e-kt

T1/2=ln2/K=0.693/K

式中：c0和ct分别为异菌脲的初始浓度和t时刻异菌脲的浓度(mg·L-1或mg·kg-1)；K为速率常数(h-1或d-1)；t为降解时间(h或d)；T1/2为降解半衰期(h或d)。

土壤迁移：土壤薄层法根据农药在薄板上的平均移动距离(Zp)与溶剂前沿(Zw)的比值求出农药在薄板上的比移值(Rf)。

式中：i为土壤薄板分割数；Zi为第i段到原点的平均距离(cm)；Mi为第i段农药含量(mg·kg-1)。

土壤淋溶：土柱淋溶法根据各段土壤及淋出液中的农药含量，分别求出其占添加总量的百分比。

式中：Ri为各段土壤及淋出液中农药含量的百分比；mi为各段土壤及淋出液中农药质量(mg)；i=1、2、3、4，分别表示0～10 cm、10～20 cm、20～30 cm土壤和淋出液；m0为农药添加总量(mg)。

2 结果与讨论(Result and discussion)

2.1 土壤类型对异菌脲降解的影响

异菌脲在4种土壤中的降解动力学结果如表2所示，从表中可以看出，异菌脲在东北黑土、青海草甸土、南京黄棕壤和江西红壤中的半衰期分别为7.2、8.6、12.7和16.9 d。降解速率常数分别为0.0958、0.0806、0.0542和0.0411 d-1。根据《化学农药环境安全评价试验准则》[18]中农药在土壤中降解性划分等级，异菌脲在这4种土壤中均属于易降解农药。

农药在土壤中的降解途径一般有微生物降解、水解和光解，避光情况下主要有农药的化学降解和微生物降解作用[19]。结合表2的结果和4种土壤类型的理化性质来看，异菌脲降解以生物降解为主，异菌脲在土壤中的降解可能与有机质含量和pH[20]有关，异菌脲在东北黑土中的降解速率是江西红壤中的2.35倍，东北黑土中有机质含量最高(4.62%)，异菌脲降解最快，而江西红壤中有机质含量最低(1.41%)，异菌脲降解最慢，说明有机质对异菌脲的降解有很大的影响。土壤有机质高，有利于土壤微生物的生长与繁殖，降解作用增强。青海草甸土与江西红壤有机质含量相近，但青海草甸土的pH较高，导致异菌脲在青海草甸土中降解速率比江西红壤中快一倍，说明土壤pH对异菌脲的降解也有一定的影响。土壤pH主要影响微生物的生存环境及活性，一些微生物在特定的pH值下具有最高的酶动力活性，且pH也会在一定程度上影响农药的水解作用，异菌脲在pH较高时水解较快。

2.2 土壤含水量和厌氧条件对异菌脲降解的影响

不同土壤含水量下，异菌脲的降解结果如图2所示。当土壤含水量为10%、20%、30%、40%和渍水时，异菌脲的降解速率常数为0.0385、0.0471、0.0702、0.0963和0.1175 d-1，降解半衰期为18.0、14.7、9.9、7.2和5.9 d。降解速率随含水量的增加而增大，渍水条件下异菌脲在土壤中的降解速率最快。好氧条件下，异菌脲在土壤中随着土壤含水量(10%～40%)增加降解速率不断增大，这可能由于土壤湿度增大，土壤微生物活动能力增强，土壤中的酶促反应更快，异菌脲降解越快[21]。而当异菌脲在渍水条件下时，异菌脲处在一个积水厌氧土壤环境中，其降解速率相比好氧条件更快，说明厌氧微生物可能起到主要的作用。

表2 异菌脲土壤降解动力学参数Table 2 Soil degradation kinetics parameters of iprodione

图2 不同土壤含水量下异菌脲在南京黄棕壤中的降解Fig. 2 Degradation of iprodione in Nanjing yellow-brown soil under different moisture

2.3 土壤微生物和有机质对异菌脲降解的影响

异菌脲在不同处理土壤中的降解动力学参数如表3所示。异菌脲在土壤中的降解受微生物和有机质影响较大，通过对土壤进行灭菌和去有机质处理，与未灭菌土壤中异菌脲的降解情况比较，异菌脲在对照组中的降解半衰期仅为12.7 d，而在灭菌土壤、去有机质土壤和同时灭菌并去有机质土壤中的降解半衰期为22.7、46.8和72.2 d，分别是对照土壤半衰期的1.8倍、3.7倍和5.7倍，即土壤微生物对异菌脲在土壤中的降解有促进作用，而土壤有机质含量对异菌脲降解影响比微生物的影响更大，这是由于土壤有机质不仅作为土壤微生物生存与繁殖的碳源，影响微生物的生长与繁殖，而且有机质中的其他成分(动植物残体及其分泌物)也能加快异菌脲的降解[22]。

2.4 异菌脲在土壤中的移动性

异菌脲在不同土壤薄层中和土柱中的分布结果如图3和图4所示。图3的薄层层析研究结果表明，异菌脲在南京黄棕壤、江西红壤、东北黑土和青海草甸土中的Rf值分别为0.19、0.29、0.17和0.17。根据《化学农药环境安全评价试验准则》，异菌脲在这4种土壤中均属于不易移动。从图4的土柱淋溶试验结果来看，在4种土柱中，淋溶速率次序为江西红壤>青海草甸土>南京黄棕壤>东北黑土，异菌脲大部分集中在0～10 cm段，该段农药百分含量均大于50%，即R1>50，根据各段土柱农药百分含量划分农药在土壤中的淋溶等级，说明异菌脲在4种土壤中均属于难淋溶。

农药在土壤中的移动性与土壤的理化性质和农药本身性质有很大关系，一般来说，有机质含量越多，对农药吸附性越大[23]，农药移动性越差，这与本试验结果相一致；而且薄层层析和土柱淋溶都是以土为载体，水为流动相，模拟自然条件下农药的移动性，农药的水溶性越大，其在土壤的吸附性越差，移动性越强，由于异菌脲在水中的溶解度只有0.013 g·L-1(20 ℃)，难溶于水，与水的亲和力弱，难随水相移动[24]，从而导致异菌脲在土壤中不易移动和难淋溶，因此，异菌脲不会通过淋溶作用进入地下水导致地下水的污染。

表3 异菌脲在不同处理土壤中降解的动力学参数Table 3 Degradation kinetic parameters of iprodione in different treatment soil

图3 异菌脲在土壤薄层层析中的分布Fig. 3 Iprodione distributed in the soils in the thin-layer chromatography test

图4 异菌脲在不同土柱中的分布Fig. 4 Iprodione distributed in the different soil columns

异菌脲在4种土壤中均属于易降解农药；土壤湿度越大，异菌脲降解越快，积水厌氧条件下，异菌脲降解最快，说明厌氧微生物对异菌脲降解起到主要作用；土壤微生物和有机质对异菌脲在土壤中降解起促进作用；异菌脲在南京黄棕壤、江西红壤、东北黑土和青海草甸土中均属于不易移动，且在4种土壤中均属于难淋溶，淋溶顺序为江西红壤>青海草甸土>南京黄棕壤>东北黑土。试验结果说明，异菌脲在土壤中易降解，不易通过移动和淋溶作用进入地下水，造成地下水污染。