丙硫菌唑对斑马鱼的安全性评价及其生物富集行为研究

郭宝元，张洋，王松雪

1. 国家粮食和物质储备局科学研究院，北京 100037 2. 中国科学院生态环境研究中心，中国科学院环境生物技术重点实验室，北京 100085

丙硫菌唑，化学名为2-(2-(1-氯环丙基)-3-(2-氯苯基)-2-羟丙基)-1-2-二氢-3-1,2,4-三唑-3-硫酮，英文名prothioconazole，CAS号178928-70-6，结构式如图1所示。熔点139.1～144.5 ℃，Henry常数<3×10-5Pa·m3·mol-1，饱和蒸气压(20 ℃)<4×10-7Pa，LogKow(20 ℃)为4.05，水中溶解度(20 ℃，pH=7)为0.3 g·L-1[1-2]。丙硫菌唑是一种广谱三唑类杀菌剂，主要防治由子囊菌、担子菌和半知菌等3类致病菌引起的病害，用于防治禾谷类作物小麦、大麦和水稻等的多种病害，同时对油菜、花生、豆类、黄瓜和番茄等的众多病害防治效果也非常好[3-5]。自2004年首获登记以来已在全球60多个国家登记并销售，在杀菌剂中就占据了重要地位。2015年，全球拥有5.00亿美元以上销售额的杀菌剂只有8个，丙硫菌唑以8.00亿美元的销售额位居第三。虽然国内目前登记工作刚刚开始，根据中国农药信息网公布的数据，迄今为止，仅海利尔和久易农业2家企业完成原药登记，海利尔、久易农业和溧阳中南化工3家企业进行了3种制剂登记，综合来看，丙硫菌唑在国内市场应该是一种非常有前景的杀菌剂[1-2]。

图1 丙硫菌唑结构式Fig. 1 The structural of prothioconazole

一般来说，农药在施用后，只有少部分能够到达其靶标，大部分会落入土壤，同时滞留在植株上的农药也会通过雨水冲刷而进入土壤，然后通过地表径流，进入水体，从而危害水生生物的安全[6]。因此，对于农药的安全评价需要考察其对水生动植物的安全性。同时，考虑到丙硫菌唑的logKow为4.05，具有比较高的疏水性，其在水生生物体内的累积作用也是不可忽视的[1]。国内丙硫菌唑的登记工作刚刚开始，目前，丙硫菌唑的研究还多集中于合成工艺优化[7-9]、药效评价[3-5]与残留方法[10-11]等方面，对于其环境安全评价研究还比较少。笔者近来发现了丙硫菌唑在生物体内代谢和累积规律[12]，以此为基础，本文开展了丙硫菌唑对斑马鱼的安全性评价及其在鱼体内的生物累积效应，以评估丙硫菌唑施用后，对水生生物的风险。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

TSQ Quantum Access MAX液相色谱-质谱联用仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；湘仪离心机1850(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；HZQ-C空气浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)。Mettler Toledo pH计(梅特勒-托利多国际有限公司)；上海雷磁JPB-607A型溶解氧分析仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

二氯甲烷(分析纯)和乙腈(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司(北京)；乙腈(色谱纯)和甲酸(色谱纯)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。95%丙硫菌唑原药和50%丙硫菌唑水分散粒剂由农业部农药鉴定所惠赠，丙硫菌唑标准品(99.5%)购自Sigma-Aldrich。涉及流动相、提取等试验步骤的用水采用Millipore超纯水设备制备。暴露用水为经过曝气的自来水。

暴露试验用水：试验用水为存放并去氯处理24 h以上的自来水。水质硬度在10～250 mg·L-1之间(以CaCO3计)，水温控制在20～25 ℃，pH在6.0～8.5之间，并且试验期间pH变化量在±0.5之间，溶解氧保持在试验温度下饱和值的60%。

供试鱼：试验用鱼为斑马鱼(Brachydaniorerio)，试验用斑马鱼为实验室繁育。选取健康无病、大小一致的斑马鱼为试验对象。试验前在与试验时相同的环境条件下驯养7 d，驯养期间每天喂食0.02 g，每日光照12 h，及时清除粪便及食物残渣。

1.2 试验方法

1.2.1 液相色谱质谱分析方法

液相色谱质谱(High Performance Liquid Chromatograph Mass Spectrometer, HPLC-MS)条件如下：流动相为V(0.33%甲酸水溶液)∶V(乙腈)=10∶90，流速为0.2 mL·min-1，色谱柱型号为Hypersil GOLD25002-102130 (100 mm×2.1 mm)，柱温为30 ℃，样品室温度为20 ℃，进样方式为自动进样，进样体积为5 μL，保留时间为1.75 min，离子源类型为ESI-，离子源温度为350 ℃。

水样前处理方式：5 mL样品，用5 mL二氯甲烷漩涡振荡3 min，重复提取一次，合并二氯甲烷。取5 mL二氯甲烷浓缩近干，用5 mL乙腈定容，超声3 min，过0.22 μL有机滤膜，待测。

鱼体前处理方式：1 g斑马鱼(湿重)研磨，加20 mL乙腈，浸泡振荡过夜，离心5 min，取上清液过膜，待测，浓度高的，稀释后进样。

1.2.2 急性毒性试验

急性毒性试验方法参考《化学农药环境安全评价试验准则 第12部分：鱼类急性毒性试验》(GB/T 31270.12—2014)。取50%丙硫菌唑水分散粒剂2.0011、4.0019 g，用曝气自来水分别溶解定容至1 000、2 000 mL，混合后得到理论浓度为1.00 g a.i.·L-1储备液，使用0.45 μm滤膜过滤后得到溶液浓度为41.2 mg a.i.·L-1。空白中不添加农药成分，其他保持一致。

用曝气水将储备液稀释为1.50、1.81、2.16、2.60和3.11 mg a.i.·L-15个浓度组。溶液配制如表1所示。

试验各浓度组均不设重复，在每个烧杯中加入2 L供试药液或试验用水后，分别放入10尾试验鱼。试验周期为96 h，每隔24 h更换原有药液。分别在试验开始后0、24、48和72 h及试验结束时，测定并记录试液的温度、pH值和溶解氧含量。并在试验开始后6、24、48和72 h及试验结束时，观察并记录试验鱼的中毒症状和死亡数目。

分别在试验开始后0和24 h更换试验溶液之前从各处理组取100 mL的供试物溶液，于冰箱中保存，用于丙硫菌唑水体浓度检测。

计算各浓度组在试验开始后24、48、72和96 h试验鱼的累计死亡率。采用SPSS软件的Probit法计算各时间点的半数致死浓度LC50及其95%置信区间。

1.2.3 斑马鱼生物富集

生物富集试验参考国家标准《化学农药环境安全评价试验准则 第7部分：生物富集试验》(GB/T 31270.7—2014)。称取1.4 g 95%丙硫菌唑原药，用水定容至1 000 mL，得到浓度为1 330 mg·L-1的储备液，过膜后浓度为204 mg·L-1。

斑马鱼急性毒性试验结果显示，96 h-LC50为2.0 mg·L-1。试验溶液配制浓度分别为96 h-LC50的1/100和1/10，即0.02和0.2 mg·L-1。

根据设定浓度，配制2 L试验水，每种浓度各16缸，每缸放置5条斑马鱼，同时设置空白。每24 h更换药液。

于0、24、48、96、144和192 h分别从各处理中取水样与鱼样，测定水样与鱼样中的供试物含量。

检测鱼体摄入丙硫菌唑的实际值。鱼体对丙硫菌唑的富集系数按公式(1)计算[12-16]。

(1)

式中：BCF为生物富集系数(bioconcentration factor)；Cfs为鱼体内的供试物含量(mg·kg-1)；Cws为水体中的供试物含量(mg·L-1)。

表1 50%丙硫菌唑水分散粒剂对斑马鱼急性毒性试验结果Table 1 Acute toxicity test results of 50% prothioconazole in Brachydonio rerio

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 LC-MS/MS分析方法

样品测定的LC-MS/MS分析方法中，线性范围为0.002～1.0 mg·L-1，标准曲线回归方程为Y= 294910x+13626，R2= 0.9931；色谱图中，在丙硫菌唑出峰的位置没有干扰峰；在水中加入丙硫菌唑原药储备液，使其浓度为0.08和1.0 mg·L-12个浓度，平均添加回收率为96.71%和90.64%，相对标准偏差(RSD)为3.56%和2.54%；在鱼体中加入丙硫菌唑原药储备液，使其浓度为0.05和10.0 mg·kg-12个浓度，平均添加回收率为85.83%和91.35%，RSD为3.66%和3.16%。方法以3倍信噪比计算的话，检测限(LOD)<0.002 mg·L-1的定量限(LOQ)时，以实际添加回收浓度为准，水中为0.08 mg·L-1，鱼中为0.05 mg·kg-1。该方法能够满足水中/鱼体中丙硫菌唑的测定要求。

2.2 丙硫菌唑对斑马鱼的急性毒性

试验期间pH值为7.6～8.1，水温为22.5～23.1 ℃，溶解氧为67%～77%，符合试验要求。试验期间空白对照试验用鱼并未出现异常情况。在试验开始后6 h，设定浓度为1.50、1.81和2.16 mg a.i.·L-1的处理组中试验鱼在烧杯底部集群游动；设定浓度为2.60、3.11 mg a.i.·L-1的处理组试验鱼反应激烈，有窜游、侧翻及失去平衡现象。试验结束后，所有5个设定浓度1.50、1.81、2.16、2.60和3.11 mg a.i.·L-1处理组均出现试验用鱼游动能力下降、躺于容器底部和死亡症状。

丙硫菌唑的设定浓度为1.50、1.81、2.16、2.60和3.11 mg a.i.·L-1，0、24 h后对应的试验用水中供试物含量均大于设定浓度的80%。

依据表1的实验结果，计算丙硫菌唑对斑马鱼的急性毒性，结果如表2所示。

大部分三唑类对大多数非靶标生物毒性比较低[17]，对鱼类表现出中等毒性[18-19]。根据国家标准《化学农药环境安全评价试验准则》中对鱼类毒性等级的划分标准，50%丙硫菌唑水分散粒剂对斑马鱼急性毒性指标96 h-LC50在1.00～10.0 mg a.i.·L-1范围内，属“中毒”级。

2.3 丙硫菌唑在斑马鱼体内的生物累积效应

根据丙硫菌唑的LC50设置丙硫菌唑在斑马鱼体内的富集试验浓度，采用1/10和1/100 LC50进行生物富集的试验，结果如图2所示。依据试验结果，丙硫菌唑在斑马鱼体内存在生物富集效应。从暴露开始，丙硫菌唑在斑马鱼体内快速累积，在0.02 mg·kg-1(1/100 LC50)水平下暴露24 h后，斑马鱼体内的丙硫菌唑的浓度达到0.302 mg·kg-1，BCF24 h为15。随后，斑马鱼体内的丙硫菌唑逐步增加。4 d(96 h)时，斑马鱼体内的丙硫菌唑浓度基本达到平衡，BCF达到30.34；到192 h(8 d)时，斑马鱼体内的浓度达到0.733 mg·kg-1，BCF8 d缓慢增长到34.36。

图2 丙硫菌唑富集系数(BCF)与暴露浓度和暴露时间的关系图注：1/100和1/10 LC50的浓度为0.02、0.2 mg·kg-1。Fig. 2 Variation of bioconcentration factor (BCF) of prothioconazole vs exposure time in Brachydanio rerio at different treatment concentrationsNote: 1/100 and 1/10 LC50 of the prothioconazole concentrations are 0.02 and 0.2 mg·kg-1.

表2 50%丙硫菌唑水分散粒剂对斑马鱼急性毒性试验的LC50Table 2 Acute toxicity test results (LC50) of 50% prothioconazole in Brachydonio rerio

在1/10 LC50(0.2 mg·L-1)水中，24 h后，斑马鱼体内的丙硫菌唑的浓度就达到0.302 mg·kg-1，BCF24 h为16.69，与1/100 LC50相当水平。而经过24 h暴露后，斑马鱼体内的丙硫菌唑浓度基本达到平衡。随后斑马鱼体内的丙硫菌唑浓度缓慢增加，生物富集因子也小幅增长，到192 h时，斑马鱼体内的丙硫菌唑浓度为4.198 mg·kg-1，BCF8 d值为19.72。

大部分三唑类农药包括丙硫菌唑在水体中水解缓慢，而在生物体内也具有比较高的稳定性，同时，它疏水性强，在生物体内的降解速度比累积速度慢，容易在生物体内累积[14-16]。经过8 d暴露，在低浓度下，生物富集因子可以达到35.36，而在比较高的环境浓度下，生物富集因子也可以达到19.72。根据《化学农药环境安全评价试验准则 第7部分：生物富集试验》(GB/T 31270.7—2014)中农药生物富集性评价标准(如表2所示)在10

丙硫菌唑对斑马鱼有一定的毒性，毒性等级为中毒，同时，在斑马鱼体内还存在生物累积效应，累积效应为中等富集性。因此，丙硫菌唑的风险，可能会通过食物链放大。在丙硫菌唑的推广和使用的过程中，应该考虑到其潜在的环境风险。