气相色谱-氮磷检测器法表征家蝇对马拉硫磷的水解代谢

2019-04-02史雪岩高希武

色谱 2019年4期

张怡, 史雪岩, 高希武

(中国农业大学植物保护学院, 北京 100193)

家蝇作为重要的病媒昆虫,对人畜健康等造成了巨大的危害[1,2]。目前对家蝇主要采用有机磷杀虫剂、拟除虫菊酯杀虫剂、多杀菌素等进行化学控制,但是随着化学杀虫剂的广泛使用,家蝇对杀虫剂的抗性普遍出现,影响了防治效果[3-5]。研究家蝇对杀虫剂的抗性机制,对于掌握家蝇的抗性水平,制定合理的家蝇治理策略十分重要。

家蝇对杀虫剂的抗性机制包括表皮变化导致的杀虫剂穿透率降低、杀虫剂靶标突变导致的对杀虫剂敏感性降低以及昆虫对杀虫剂的解毒代谢能力增强导致的代谢抗性等[6]。目前,对于家蝇的杀虫剂代谢抗性机制研究,已经从生化水平的解毒酶活性研究,深入到分子水平的解毒酶基因研究等。其中,比较研究抗性与敏感昆虫对杀虫剂的代谢能力差异,可以为表征抗性昆虫对杀虫剂的代谢抗性提供直接的证据。因此,准确表征抗性昆虫和敏感昆虫对杀虫剂的代谢能力差异,十分重要。

马拉硫磷是一种有机磷杀虫剂,具有对害虫防治效果好、对人低毒的选择性,被广泛用于家蝇防治[7],但是家蝇对马拉硫磷的抗性已被报道[8]。有机磷杀虫剂的生物代谢转化反应主要包括氧化、水解、轭合等,其中,水解是有机磷杀虫剂在生物体内发生的重要解毒代谢反应之一[9]。对马拉硫磷的代谢研究表明,羧酸酯酶对马拉硫磷分子中的羧酸酯键具有一定的水解作用。在哺乳动物体内,马拉硫磷容易被羧酸酯酶水解成低毒的马拉硫磷一元羧酸而解毒,但是在昆虫中这个解毒反应活性很低,因而马拉硫磷在昆虫中难以解毒,而对昆虫产生毒杀作用[9,10]。研究[10,11]发现,昆虫对有机磷的抗性与其对有机磷的水解解毒能力增强有关。如抗有机磷类杀虫剂的蟑螂和苍蝇种群的抗性产生与脂族酯酶包括羧酸酯酶的过量表达有关。此外,研究[10-12]表明,一些昆虫对有机磷的水解抗性与酯酶突变有关,并且这个突变还伴随着脂族酯酶活性的降低,因而提出了脂族酯酶突变理论。但是,对于直接比较敏感昆虫和抗性昆虫对马拉硫磷的水解能力差异,还很少研究。

为表征昆虫解毒代谢酶对马拉硫磷的代谢能力,可以通过分析马拉硫磷与昆虫解毒酶温育后,马拉硫磷的含量变化而进行。因此准确分析马拉硫磷的含量很重要。对于马拉硫磷等有机磷杀虫剂的分析,可以采用的方法有气相色谱-火焰光度法[13,14]、气相色谱-氮磷检测器(GC-NPD)法[15]、GC-MS法[16-18]、UPLC-MS/MS法[19]等。其中气相色谱配高灵敏度、高选择性的NPD,在含氮及含磷化合物的分析检测中,被广泛应用[20]。GC-NPD已被用于有机磷杀虫剂马拉硫磷的检测。用乙腈提取甘蓝样品中的有机磷农药后,使用配有DB-1701毛细管柱的GC分离,再用NPD检测,可成功测定包括马拉硫磷在内的5种有机磷杀虫剂残留[15]。对猪肉样品,用乙酸乙酯与正己烷的混合物提取后,用HP-1毛细管气相色谱柱进行分离,用GC-NPD法分析测定二嗪农残留[21]。对甘蔗汁样品,使用QuEChERS结合GC-NPD法可成功测定其中的有机磷农药残留量[22]。此外,用正己烷抽提昆虫羧酸酯酶与马拉硫磷的混合物后,使用GC-NPD测定了7种昆虫野生型和两种突变型的羧酸酯酶对马拉硫磷的降解,发现突变能使一些昆虫的羧酸酯酶对马拉硫磷的降解活性增加[12]。家蝇等昆虫样品具有脂肪含量高、基质干扰强的特点,导致昆虫样品中马拉硫磷的提取效率较低、难以分析准确。本研究使用2∶1(v/v)的乙酸乙酯与正己烷混合物作为提取剂,可以高效地提取家蝇酶制备液中的马拉硫磷,并进行准确分析。因此,在筛选获得了对马拉硫磷具有624倍抗性的家蝇品系的基础上,用常规模式底物α-萘乙酯(α-NA)表征了敏感及抗性家蝇的羧酸酯酶活性差异,并使用GC-NPD比较了抗性及敏感家蝇酶制备液对马拉硫磷的水解代谢差异。该研究为明确家蝇对马拉硫磷的代谢抗性机制,提供了研究数据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

HP 6890+气相色谱仪,配有分流/不分流进样口和NPD;数据采集使用Agilent Chromatograpahic Data Station(美国Agilent公司)。Eppendorf Centrifuge 5417C/R型台式高速(冷冻)离心机(德国Eppendorf公司); UV2550型紫外分光光度计(日本Shimadu公司), Tecan Spectra Rainbow Microplate Reader(瑞士TECAN公司)。

α-NA(纯度≥98%)、毒扁豆碱(eserine,纯度≥98%)、固蓝B盐(fast blue B salt,纯度≥80%)均购自美国Sigma-Aldrich公司;考马斯亮蓝G-250(分析纯)购自上海化学试剂公司。牛血清白蛋白(BSA,纯度≥98%)购自北京同正生物公司。十二烷基硫酸钠(SDS)、KH2PO4及Na2HPO4等均为分析纯,购自北京化学试剂公司产品;正己烷(色谱纯)、乙酸乙酯(色谱纯)均购自美国Fisher公司。马拉硫磷原油(纯度≥96%)购自山东德州农化公司。

供试家蝇:室内饲养的条件为光照14 h,温度为(25±1) ℃,相对湿度为60%～70%,用水、糖和奶粉饲养。由中国农业大学毒理实验室饲养。其中,马拉硫磷敏感家蝇品系(SS)是1987年从台湾大学获赠,已经在实验室内没有接触任何杀虫剂的条件下,饲养超过了40年。马拉硫磷抗性家蝇品系(RS)是通过将2007年采自中国农业大学的家蝇,用马拉硫磷筛选获得。筛选参考文献[11]进行。具体的筛选方法是通过将马拉硫磷的丙酮溶液点滴在刚孵化的家蝇的前胸背板,其中马拉硫磷的使用剂量可以导致受试家蝇60%～80%的死亡率,在处理后72 h,将仍存活的家蝇作为母体继续繁殖下一代。通过连续多代的筛选,获得了624倍抗性的马拉硫磷抗性品系(RS)。其中,对敏感家蝇品系,马拉硫磷的半致死剂量(LD50)为0.83 μg/fly(95%置信区间为0.71～0.97 μg/fly),对抗性家蝇品系,马拉硫磷的LD50为518 μg/fly(95%置信区间为470～5 690.71 μg/fly)[11]。分别收集敏感、抗性雌家蝇成虫,去头后,取腹部用于实验。

1.2 色谱条件

色谱柱为HP-5(30 m×0.25 mm×0. 31 μm,美国Agilent公司)。气化室温度为280 ℃,检测器温度为325 ℃,柱温为200 ℃。载气为高纯氮气(纯度99.9%)。载气流速为2.1 mL/min。采用分流进样,分流比为5∶1,进样量为2 μL。

1.3 家蝇酶匀浆液的制备

解剖获得4日龄的雌家蝇成虫腹部,将5个雌家蝇腹部用冰冷0.1 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液匀浆,在4 ℃下以12 097 r/min的速度离心15 min。收集上清液,作为酶制备液,用于体外测定其对α-NA及马拉硫磷的代谢活性。其中,每个家蝇品系均分别制备3个酶制备液,作为3个生物学重复。

使用考马斯亮蓝G-250方法测定家蝇酶制备液的蛋白质含量。采用3 mL的反应体系:0.5 mL酶制备液及2.5 mL考马斯亮兰G-250。室温反应5 min后,测定595 nm下的吸光值。以牛血清白蛋白作标准曲线,计算酶制备液中蛋白质的含量。

为了研究家蝇对马拉硫磷的抗性与家蝇对马拉硫磷的水解活性的关系,分别测定了马拉硫磷抗性家蝇和敏感家蝇对模式底物α-NA、马拉硫磷的水解代谢活性。

1.4 家蝇酶制备液对α-NA的水解活性测定

羧酸酯酶活性的测定参照文献方法[11]进行。以α-NA(母液浓度为3×10-2mol/L)为底物,使用时与毒扁豆碱(母液浓度为3×10-2mol/L)一起用0.1 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液(PBS)稀释至3×10-4mol/L。取50 μL酶制备液加入到含0.45 mL 0.04 mol/L pH 7.0的PBS以及3.6 mL 3×10-4mol/Lα-NA的反应溶液中启动反应,在30 ℃恒温水浴中振摇反应15 min后,加入0.9 mL显色剂(体积比为1∶1的0.01 g/mL固蓝B盐水溶液与0.05 g/mL SDS水溶液的混合液)终止反应,于600 nm下测定光吸收值。每个处理重复3次,每个重复进行3次测定。将所测定的吸光值除以所使用的酶蛋白含量和酶反应时间,即可计算出羧酸酯酶的比活力。因此,以mOD/(mg protein·min)作为羧酸酯酶比活力的单位。

1.5 家蝇酶制备液对马拉硫磷的水解代谢活性测定

用家蝇酶制备液进行对马拉硫磷水解代谢反应的体系总体积为800 μL。其中,含有100 μL的家蝇酶制备液,0.1 mmol/L马拉硫磷作为底物,在30 ℃下温育45 min。反应完毕,加入1 mL冰冷的乙酸乙酯-正己烷(2∶1, v/v),涡旋后,收集有机相,共萃取3次。合并3次萃取液,用无水硫酸钠干燥后,转移至新的玻璃管中,N2吹浓缩至干,用200 μL正己烷定容后,用于GC-NPD分析代谢反应后马拉硫磷的剩余量。其中,每个酶代谢反应重复3次。其中,设酶液对照(不加底物)和底物对照(不加酶液),以确保检测的马拉硫磷来自酶促反应体系,而不是来自酶或底物。

将GC-NPD所测定的马拉硫磷峰面积,用马拉硫磷的标准曲线换算为酶代谢反应后的马拉硫磷量。根据所加底物的量及酶反应后剩余马拉硫磷的量,即可计算出酶代谢反应所消耗的马拉硫磷的量；再除以所使用的酶蛋白含量和酶反应时间,即可计算出家蝇羧酸酯酶对马拉硫磷的水解代谢比活力,因此,酶活性的单位为nmol malathion/(mg protein·min)。

1.6 数据统计方法

利用统计分析软件GraphPad Instat 3.00对数据进行统计分析,采用t-检验分析两组数据的差异显著性,以P<0.05作为差异显著性标准。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

在本文使用的GC-NPD分析马拉硫磷的条件下,马拉硫磷的标准曲线为y=0.269 4x-0.357 9,x为马拉硫磷的峰面积,y为马拉硫磷的浓度(μmol/L),相关系数R2=0.998。马拉硫磷的检出限为1.982 ng。家蝇酶制备液中添加水平为0.075、0.15、0.75和1.5 mmol/L的马拉硫磷回收率分别为87.55%±3.00%、89.4%±3.60%、91.27%±2.34%、96.00%±0.09%。表明本工作使用的GC-NPD分析马拉硫磷的方法具有良好的灵敏度及准确度,可用于家蝇酶制备液代谢反应中马拉硫磷含量的测定。

图 1 家蝇酶制备液对马拉硫磷的水解代谢Fig. 1 Hydrolytic metabolism of malathion by the homogenate of M. domestica

2.2 敏感家蝇、抗性家蝇酶制备液对α-NA的水解活性

马拉硫磷敏感、抗性家蝇酶制备液对α-NA的水解活性见表1。结果表明,以α-NA为底物,马拉硫磷抗性家蝇的酶制备液对α-NA的水解活性明显高于敏感家蝇,是敏感家蝇水解酶活性的1.39倍。

表 1 马拉硫磷敏感、抗性家蝇酶制备液对α-NA及马拉硫磷的水解活性(n=3)Table 1 Hydrolysis activities of the enzyme preparation of malathion-susceptible and resistant Musca domestica (M. domestica) to α-naphthyl acetate (α-NA) and malathion (n=3)

The hydrolysis activity data were presented as mean±standard error (SE) of the three replicates. * significantly different (P<0.05, using pairedt-tests).

2.3 敏感家蝇、抗性家蝇酶制备液对马拉硫磷的水解活性差异

马拉硫磷敏感、抗性家蝇酶制备液对马拉硫磷的水解活性结果见表1和图1。从图1可以看出,与敏感家蝇酶制备液温育后导致的马拉硫磷减少量相比,抗性家蝇酶制备液与马拉硫磷温育后,马拉硫磷减少的更多,表明抗性家蝇对马拉硫磷的水解活性显著超过了敏感家蝇的代谢活性。从表1的结果可以看出,抗性家蝇是敏感家蝇对马拉硫磷的水解活性的6.68倍。

已有研究报道了抗性昆虫的羧酸酯酶对模式底物α-NA的水解活性增加与昆虫对杀虫剂的抗性有关。因此,很多研究[10]将昆虫对α-NA的水解活性,用于表征昆虫对杀虫剂的代谢抗性。但是,在对有机磷杀虫剂产生抗性的一些昆虫中,却观察到了昆虫羧酸酯酶对α-NA水解活性的降低,并因此提出了“脂族酯酶突变”理论[23,24],认为在对有机磷产生抗性的昆虫中,可以水解α-NA的脂族酯酶发生了突变,导致了脂族酯酶对于α-NA的水解能力降低,同时却增加了其对有机磷杀虫剂的水解代谢能力。因此,表征昆虫对α-NA的水解能力,不能准确表征昆虫对有机磷杀虫剂的代谢及相关抗性。

由于昆虫酶制备液对不同底物的水解能力与底物的结构密切相关,使用杀虫剂作底物才能准确表征昆虫酶制备液对杀虫剂的水解代谢能力。因此,本研究直接使用杀虫剂马拉硫磷作底物,比较研究了马拉硫磷抗性、敏感家蝇对马拉硫磷的水解代谢活性差异,并与对α-NA的水解代谢活性差异进行了比较。结果表明,与敏感家蝇相比,抗性家蝇对α-NA的水解能力增加到原来的1.39倍,而对马拉硫磷的水解能力增加到原来的6.68倍,说明抗性家蝇酶制备液对α-NA和马拉硫磷的水解能力均有所增加,但增加的程度有所不同,因此,仅检测昆虫酶制备液对α-NA的水解能力不能准确表征其对马拉硫磷的代谢能力。在本研究结果中,抗性家蝇对马拉硫磷的水解代谢能力显著增强,这为明确家蝇对马拉硫磷的水解代谢能力增强导致了家蝇对马拉硫磷有抗性提供了直接的证据,然而研究结果同时表明，抗性家蝇对以α-NA为代表的羧酸酯的水解能力并没有增强很多,这也在一定程度上,与脂族酯酶突变理论一致。

对昆虫代谢抗性机制的研究,目前已从表征解毒酶活性变化的生化机制研究深入到表征解毒酶基因变化的分子机制研究。虽然本研究表明抗性家蝇的羧酸酯酶制备液对马拉硫磷的代谢能力显著升高,但是对于这是由于羧酸酯酶表达量的增加还是由于羧酸酯酶突变导致的代谢能力增强所致,还需要深入研究其分子机制而确定。此外,本研究使用的解毒酶是雌家蝇腹部制备的粗酶液,为准确表征解毒酶对杀虫剂的代谢,还应把相关的解毒酶基因进行克隆及表达后,深入研究其对马拉硫磷的代谢,将可以得到更为准确的结果。

本研究明确了家蝇羧酸酯酶对马拉硫磷水解能力的增加是家蝇对马拉硫磷抗性的机制之一,对于开发马拉硫磷水解酶的抑制剂、提高家蝇对马拉硫磷的敏感性、有效使用马拉硫磷进行家蝇治理具有重要意义。此外,研究结果对于将相关的解毒酶基因进行干扰,降低其对马拉硫磷的水解代谢能力,有效进行家蝇治理也提供了研究基础。昆虫杀虫剂的抗性机制是多方面的因素导致的,除代谢抗性外,靶标抗性和穿透抗性对家蝇马拉硫磷抗性的贡献,还需要使用其他方法进行表征和研究。