啶氧菌酯对斑马鱼的安全性评价及其生物富集行为研究

郭宝元，张洋，王松雪

1. 国家粮食和物质储备局科学研究院，北京 100037 2. 中国科学院生态环境研究中心，中国科学院环境生物技术重点实验室，北京 100085

啶氧菌酯，化学名为(E)-3-甲氧-2-[2-[6-(三氟甲基)-2-吡啶氧甲基]苯基]丙烯酸甲酯，英文名为picoxystrobin，CAS号为117428-22-5，结构式如图1所示。熔点为75 ℃，水中溶解度为0.128 mg·L-1，LogKow(20 ℃)为4.48[1]。啶氧菌酯主要用于防治麦类的叶面病害如叶枯病、叶锈病、颖枯病、褐斑病和白粉病等，与其他甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂相比，其对小麦叶祜病、网斑病和云纹病有更好的效果[2-3]。啶氧菌酯最早由先正达公司于2001年在欧洲推出，随后在全球得到广泛应用。但在之后的研究中发现，啶氧菌酯对水生生物存在着比较大的毒性，同时，其代谢产物具有潜在的致癌性，因此给其应用前景带来一层阴影。

图1 啶氧菌酯结构式Fig. 1 The structure of picoxystrobin

农药施用的目的是达到病虫害的防治作用，而农药施用后，只有少部分可到达靶标，大部分则进入土壤，同时即使达到靶标的农药，也会通过雨水冲刷而进入土壤，后通过地表径流，进入水体，从而危害到水生生物的安全[4]。因此，对于农药安全评价的一个重要环节是考察其对水生动植物的安全性。同时，考虑到啶氧菌酯logKow为4.48，具有强疏水性，可能在水生生物体内存在累积作用，从而对水生生物造成更大危害，乃至通过食物链传导到食物链的其他环节[5]。

国内啶氧菌酯的登记工作刚刚开始，至2018年，在国内已经有8家企业成功登记该农药[1]。而对啶氧菌酯的研究，已经涉及到其合成工艺优化[6]、药效评价[7]、残留检测方法[8-10]以及在水土界面的环境行为等方面，对于其环境安全评价的研究还比较少。因此，本文开展啶氧菌酯对生物斑马鱼的安全性和风险研究，并考察其在生物体内的生物累积效应，以评估啶氧菌酯施用后，对水生食物链的风险。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 材料与试剂

TSQ Quantum Access MAX液相色谱-质谱联用仪购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；HZQ-C空气浴振荡器购自哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；湘仪离心机1850购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Mettler Toledo pH计购自瑞士苏黎世的梅特勒-托利多集团；上海雷磁JPB-607A型溶解氧分析仪购自上海仪电科学仪器股份有限公司。

乙腈(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司(北京)；乙腈(色谱纯)和甲酸(色谱纯)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。95%啶氧菌酯原药由农业部农药鉴定所惠赠，啶氧菌酯标准品(99.5%)购自Sigma-Aldrich。涉及流动相、提取等过程的用水采用Millipore超纯水设备制备。暴露用水为经曝气的自来水。

1.2 分析方法

流动相为V(0.33%甲酸水溶液)∶V(乙腈)=10∶90，流速0.2 mL·min-1；色谱柱型号Hypersil GOLD25002-102130 (100 mm×2.1 mm)，柱温30 ℃，样品室温度20 ℃；进样方式为自动进样，进样体积5 μL；保留时间为1.75 min；离子源类型为ESI-，离子源温度350 ℃。

水样前处理方式：5 mL样品，用5 mL二氯甲烷漩涡振荡3 min，重复提取一次，合并二氯甲烷。取5 mL二氯甲烷浓缩近干，用5 mL乙腈定容，超声3 min，过0.22 μL有机滤膜，待测。

鱼体样品前处理方式：1 g鱼体样品研磨(湿重)，加20 mL乙腈，浸泡振荡过夜，离心5 min，取上清液过膜，待测；如有浓度高的样品，稀释后进样。

1.3 急性毒性试验

取95%啶氧菌酯原药0.3065 g，以适量二甲基亚砜作为助溶剂，以吐温80为稳定剂，用去离子水溶解定容至100 mL，得3.00 g a.i.·L-1储备液。用曝气自来水稀释得到浓度为0.0300、0.0390、0.0507、0.0658和0.0856 mg a.i.·L-1的5组试验处理药液，以曝气自来水为空白对照，以与最高浓度中二甲基亚砜和吐温80含量相同的溶液为溶剂对照，对照组和各处理组均只设1个重复。每个烧杯中装有2 L药液，分别放入10尾斑马鱼。试验期间不曝气、不喂食。分别于24、48、72和96 h观察斑马鱼中毒症状和死亡情况。

分别在试验开始后0和24 h更换试验溶液之前从各处理组取100 mL的供试物溶液，于冰箱中保存，用于啶氧菌酯水体浓度检测。

计算各浓度组在试验开始后24、48、72和96 h试验鱼的累计死亡率。采用SPSS软件的Probit法计算各时间点的半数致死浓度(LC50)及其95%置信区间。

1.4 斑马鱼生物富集

称取1.4 g 95%啶氧菌酯原药，用水定容于1 000 mL容量瓶中，得到浓度为1 330 mg·L-1的储备液，过膜后浓度为204 mg·L-1。

经斑马鱼急性毒性试验得到96 h-LC50为0.0509 mg·L-1。试验溶液配制浓度分别为96 h-LC50的1/100和1/10，即0.0005和0.005 mg·L-1。

根据设定浓度，配制2 L试验水，每种浓度各16缸，每缸放置5条斑马鱼，同时设置空白对照。每24 h更换药液。

于0、24、48、96、144和192 h分别从各处理中取水样与鱼样，测定水样与鱼样中的供试物含量。

检测试验过程中鱼体内啶氧菌酯浓度，啶氧菌酯的生物富集系数按公式(1)计算：

(1)

式中：BCF为生物富集系数(bioconcentration factor)；Cfs为鱼体内的啶氧菌酯含量(mg·kg-1)；Cws为水体中的啶氧菌酯含量(mg·L-1)。

2 结果(Results)

2.1 LC-MS/MS分析方法

使用LC-MS/MS测定样品，其线性范围为0.001～1.5 mg·L-1，标准曲线回归方程为Y= 37739475398x+509582745，R2= 0.9920；色谱图中，在啶氧菌酯出峰的位置没有干扰峰；在水中加入啶氧菌酯原药储备液，使其浓度为1.0和0.001 mg·L-12个浓度，平均添加回收率为88.99%～105.10%，相对标准偏差(RSD)为4.83%～5.5%，最低检测浓度为0.001 mg·L-1；在鱼体中加入啶氧菌酯原药储备液，使其浓度为0.004和5.2 mg·kg-12个浓度，平均添加回收率为72.07%～108.16%，RSD为2.53%～7.44%，最低检测浓度为0.004 mg·kg-1；该方法能够满足水中/鱼体啶氧菌酯的测定的要求。

2.2 啶氧菌酯对斑马鱼的急性毒性

试验期间pH值范围为7.6～8.1，水温范围为23.0～25.0 ℃，溶解氧在65%～77%范围内，符合试验要求。啶氧菌酯的设定浓度为0.300、0.390、0.507、0.658和0.856 mg a.i.·L-1，0、24 h后对应的试验用水中啶氧菌酯浓度降低1.58%～6.75%，啶氧菌酯浓度均大于设定浓度的80%。试验期间空白对照试验用鱼并未出现异常情况。各啶氧菌酯处理组斑马鱼均表现出兴奋，尤其高浓度处理组的斑马鱼，随着时间的延长，鱼开始游动失衡，鱼体侧翻，游速缓慢，反应迟钝，严重的出现死亡。

表1 95%啶氧菌酯原药对斑马鱼(Brachydonio rerio)急性毒性试验结果Table 1 Acute toxicity test results of 95%picoxystrobin in Brachydonio rerio

依据表1的实验结果，计算啶氧菌酯对斑马鱼的急性毒性，96 h-LC50为0.0509 mg a.i.·L-1，95%置信区间为0.0314～0.0641 mg a.i.·L-1。根据国家标准《化学农药环境安全评价试验准则》中对鱼类的毒性等级划分标准，95%啶氧菌酯对斑马鱼急性毒性指标96 h-LC50<0.1 mg a.i.·L-1，属“剧毒”级。

2.3 啶氧菌酯在斑马鱼体内的生物累积效应

啶氧菌酯对斑马鱼的毒性属剧毒，而它同时还可能存在着生物累积效应，因此，啶氧菌酯对斑马鱼等水生生物形成更大安全风险。根据LC50设置啶氧菌酯的生物富集试验浓度，采用1/10和1/100 LC50啶氧菌酯进行生物富集的试验，结果如图2所示。结果表明，啶氧菌酯在斑马鱼体内存在明显的生物富集效应。从暴露开始，啶氧菌酯在斑马鱼体内有一个快速累积的过程，在0.005 mg·L-1(1/100 LC50)水平下暴露24 h后，斑马鱼体内的啶氧菌酯的浓度就达到0.037 mg·kg-1，BCF24 h达到61.67，随后，斑马鱼体内的啶氧菌酯增加速度变得缓慢。到第2天(48 h)时，斑马鱼体内的啶氧菌酯浓度基本达到平衡，BCF达到73.33，到第8天(192 h)时，斑马鱼体内的浓度达到0.048 mg·kg-1，BCF8 d缓慢增长到80.00。

在更高浓度的暴露环境中，在1/10 LC50(0.005 mg·L-1)水中，24 h后，斑马鱼体内啶氧菌酯浓度就达到平衡，约为0.553 mg·kg-1，BCF24h基本达到106.35。随后斑马鱼体内的啶氧菌酯浓度维持平衡，生物富集因子也小幅波动，到192 h后，斑马鱼体内的啶氧菌酯浓度为0.527 mg·kg-1，BCF8 d值为99.42。

农药等化学品的生物富集性，一般认为是与其Kow相关。通常Kow越大，生物累积性越高，如蒽的logKow= 4.45，其在斑马鱼体内的生物累积大约是2.48×104～6.14×104 [11-13]。啶氧菌酯的logKow=4.48，虽然与蒽接近，但其在斑马鱼体内的富集效应在80.00～99.43之间，相差达2～3个数量级。此结果表明，一方面，啶氧菌酯可以在生物体内富集；另外一方面，其在生物体内存在代谢过程，使其在富集平衡时，生物富集因子远远低于多环芳烃的富集因子。

3 讨论(Discussion)

根据《化学农药环境安全评价试验准则》，啶氧菌酯对斑马鱼有剧毒。啶氧菌酯在水体中水解缓慢，而在生物体内也具有比较高的稳定性，同时，其疏水性强，在生物体内的降解速度比累积速度慢，容易在生物体内累积。经过8 d暴露，在低浓度下，生物富集因子可以达到80.00，而在比较高的环境浓度下，生物富集因子也可以达到99.42。根据GB/T 31270.7—2014《化学农药环境安全评价试验准则 第7部分：生物富集试验》中农药生物富集性评价标准，在10

图2 斑马鱼体内啶氧菌酯富集系数(BCF)的变化规律Fig. 2 Variation of picoxystrobin bioconcentration factor (BCF) in Brachydanio rerio