响应面法优化天然抗氧化剂抑制调理鸡排褪色和脂质氧化工艺

鲁 青，黄继超，朱宗帅，刘冬梅，黄 明,3,*

（1.南京农业大学食品科技学院，农业部肉品加工重点实验室，肉品加工与质量控制教育部重点实验室，江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095；

2.南京农业大学工学院，江苏 南京 210095；3.南京黄教授食品科技有限公司，江苏 南京 210095）

鸡肉深加工制品占我国鸡肉制品的5.8%，远落后于全球鸡肉平均深加工比例（20%）[1]，表明我国调理鸡肉在生产加工方面存在很大的上升空间和发展潜力[2]。调理鸡排是鸡肉精深加工制品中较为流行的一类肉制品，它是以鸡胸肉为原料，经切片、整型后，添加适量的调味料和香辛料与之进行滚揉、静腌等加工工艺，再经油炸、煮制或直接速冻而成的一类调理肉制品。现代工业化生产调理鸡排过程中会添加适量的辣椒红色素到腌制液中，以赋予调理鸡排诱人色泽，提高消费者对产品的购买欲。辣椒红色素不仅是国际上公认的天然色素，还具有鲜艳的颜色、极强的着色力、营养卫生等优点[3-4]，但由于辣椒红色素具有高度不饱和双键系统[5-6]，其应用到调理鸡排中极易发生氧化降解而使产品出现褪色现象。而颜色是评价调理鸡排重要的感官指标，当肉制品发生褪色现象，即使有良好的风味和口感也得不到消费者青睐[7]，大大降低产品的商业价值。脂质氧化也是引起肉制品贮藏期间褪色的重要原因[8]。Zakrys等[9]研究发现肉制品红度值的变化规律与硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值的相关性显著，脂质氧化可能会引起氧合肌红蛋白氧化而导致肉制品的红度值发生变化。

抗氧化剂的添加是抑制辣椒红色素氧化降解的有效手段，其在低浓度下可有效延缓易氧化生物分子氧化，将其添加到肉制品中还可有效延缓产品品质的劣变[10]。经研究报道发现迷迭香提取物和抗坏血酸均具有抑制辣椒红色素氧化降解、延缓脂质氧化的特性，且属于天然抗氧化剂，安全性高。迷迭香提取物是禽肉制品中研究最广泛的一种天然抗氧化剂，它正逐渐替代合成抗氧化剂，开启“天然食品”新趋势[10]。迷迭香提取物中含有迷迭香酸、鼠尾草酸及其他咖啡酸衍生物等物质，能有效稳定自由基和阻断氧化反应链[11]。抗坏血酸是天然存在的具有抗氧化性的多羟基化合物，因其结构中含有还原性强的烯二醇，是一种优良的抗氧化物质。有研究证明抗坏血酸添加到辣椒粉中可以破坏氧化反应链而抑制其氧化进程，是重要的断链抗氧化剂[12]；添加到禽肉中可以作为电子供体减少活性氧物质的释放，抑制肉制品贮藏期间的脂肪氧化[13]。

抗氧化剂对辣椒红色素稳定性的研究较多，但对肉制品中辣椒红色素的颜色稳定性报道较少且集中在畜肉制品中，例如陈菁[14]研究抗氧化剂对猪肉糜中辣椒红色素稳定性的影响；国外有学者探究天然抗氧化剂对辣椒红萨拉米香肠中红度值的影响[15]。但是抗氧化剂对冷冻调理鸡胸肉中辣椒红色素和脂质氧化的抑制作用鲜见报道；另一方面，迷迭香提取物和抗坏血酸复合使用时对辣椒红色素稳定性和鸡排脂质氧化的影响也鲜见报道。本实验以调理鸡排为主要原料，探究迷迭香提取物和抗坏血酸添加量对调理鸡排褪色和脂肪氧化的影响，通过单因素试验结合中心组合试验，优化2 种抗氧化剂保持调理鸡排颜色稳定、抑制脂肪氧化的最佳添加量，为加强工业化生产的调理鸡排颜色和脂肪氧化稳定性提供工艺参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冻鸡大胸由江苏益客食品集团股份有限公司提供，每块鸡胸肉规格为（180±20）g；辣椒红色素河北省晨光生物科技集团股份有限公司；抗坏血酸（食品级） 河南百盛生物科技有限公司；迷迭香提取物（食品级） 河南豫中生物科技有限公司；2-硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、1,1,3,3-四乙氧基丙烷（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

CHROMA METER CR-400便携式色差仪 日本Konica Minota公司；ESK125真空滚揉机 德国Kakona GmbH公司；HB-3D多用途食品切片机 北京南常肉食机械有限公司；SIM-F124制冰机 日本三洋电子有限公司；IKA-Ultra-Turrax T-25匀浆机 德国Braun公司；Allegra 64R高速冷冻离心机 美国Beckman公司；M2e多功能酶标仪 德国IKA公司；AUY120型电子分析天平 日本Shimazu公司；万分之一电子天平美国梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 调理鸡排制作的工艺流程

鸡胸肉解冻→切片→修整、称质量→加入腌制液→滚揉→-20 ℃冷冻→包装→-10 ℃贮藏

1.3.2 操作要点

将冷冻的鸡胸肉置于空气中解冻，待鸡胸肉解冻至中心温度为（-6±2）℃后用切片机切成1 cm厚度的片；剔除表面明显的脂肪和结缔组织，然后将其修整成高×宽×长（1 cm×5 cm×5 cm）的规则方块；将修整后的鸡胸肉平均分为11 组并依次称质量待滚揉。腌制液在鸡胸肉切片前12 h配制好混匀后置于4 ℃冷库中贮藏待用，待鸡胸肉分组称质量后依次称取相对应的腌制液质量；并按试验设计依次称取不同种类和添加量的抗氧化剂，加入到对应的腌制液中，将腌制液和抗氧化剂搅拌均匀后和鸡胸肉块一同放入滚揉机中进行连续性滚揉30 min。滚揉后将样品置于4 ℃冷库中静腌16 h，然后迅速置于-20 ℃冻库冷冻24 h，使其中心温度降至-18 ℃。最终将样品置于-10 ℃冰箱中贮藏。

滚揉条件：真空度0.08 MPa，转速30 r/min，转筒倾角45°，连续式滚揉30 min。

腌制液配方（以1 kg鸡胸肉计）：水250 g；食盐14 g；白砂糖35 g；复合磷酸盐3 g；大豆分离蛋白10 g；玉米淀粉30 g；色拉油1 g；辣椒红色素1 g。

1.3.3 单因素试验

根据GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》，迷迭香提取物在调理肉制品中的最大添加量为0.3 g/kg、抗坏血酸在调理肉中的最大添加量按生产需求适量使用。因此单因素设定的迷迭香提取物和抗坏血酸添加量均为0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 g/kg（以肉质量计）；同时设置不添加抗氧化剂的空白对照组。在第0、40、50、60、70、80天随机选取样品测定其红度（a*）值，在第0、40、80天测定其脂肪氧化值。

1.3.4 响应面优化试验

综合单因素试验结果，根据中心组合试验设计原理，以迷迭香提取物和抗坏血酸添加量为自变量，调理鸡排的a*值和脂肪氧化值为响应值，设计2因素5水平共13 个试验点的响应面试验。考察迷迭香提取物和抗坏血酸添加量对调理鸡排颜色和脂肪氧化的影响，确定2 种添加剂保持颜色和脂肪氧化稳定性的最佳复配工艺。试验因素和水平见表1。

表1 响应面优化试验设计因素与水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in response surface design

1.3.5 验证实验

按照单因素试验和响应面试验结果获得的最佳工艺，制作调理鸡排，比较和分析第50天时调理鸡排的a*值和脂肪氧化值。

1.3.6 肉色测定

使用CR-400（D65光源）色差仪测定调理鸡排表面的色泽。色差仪使用前需要用标准白板对色差仪的光源（D65光源）进行校正，在室内光照条件下测定样品表面的色泽，每个处理组随机选取10 份大小一致、着色均匀的鸡排，每份鸡排上随机取5 个点测定a*值，测定在同一温度、同一光源的环境下进行。

1.3.7 TBARS值的测定

脂肪氧化的测定参照Salih[16]和Ultrera[17]等的方法并略作修改。称取5 g绞碎均匀的肉样于80 mL离心管内，与25 mL 7.5 g/100 mL TCA溶液混合，冰浴条件下9 000 r/min匀浆2 次，每次匀浆20 s，间歇10 s；匀浆后得到的混合液置于冷冻离心机中，于12 000×g、4 ℃离心10 min。准确吸取2 mL离心上清液并加入等体积0.02 mol/L TBA涡旋混匀，用2 mL蒸馏水取代上清液与2 mL TBA混匀后用来调零，随即置于100 ℃沸水中水浴40 min；加热后将不同处理组的混合液流水冷却至室温后测定其在532 nm波长处吸光度。用不同浓度梯度的1,1,3,3-四乙氧基丙烷稀释液吸光度制作标准曲线，根据标准曲线方程计算样品的TBARS值，计算结果表示为1 kg调理鸡排中所含有的丙二醛质量（mg/kg）。

1.4 数据统计分析

颜色指标测定重复10 次，脂肪氧化测定重复5 次，数据结果表示为。数值显著性分析采用SAS 9.2中Duncan's multiple-range test；所有图形的绘制用Origin 9.0制作；Design-Export 8.0.6软件设计响应面试验并分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 迷迭香提取物添加量对调理鸡排a*值的影响

由表2可知，迷迭香提取物添加量对调理鸡排a*值具有显著性影响；在相同贮藏时间下，随着迷迭香提取物添加量的增加，鸡排a*值呈现先上升后降低的趋势；当添加量为0.18 g/kg时，其a*值保持最稳定，贮藏80 d后a*值损失率仅为2.8%，而添加0、0.06、0.12、0.18、0.24、0.3 g/kg处理组a*值依次下降10.7%、7.1%、6.2%、5.7%、5.8%。和空白对照组相比，添加0.06 g/kg处理组的a*值从第60天开始与对照组间没有显著差异（P＞0.05）；当迷迭香提取物添加量大于0.06 g/kg时均可显著提高鸡排的a*值，添加量0.24、0.3 g/kg处理组的a*值在贮藏期间的下降率高于0.18 g/kg处理组。

表2 迷迭香提取物添加量对辣椒红调理鸡排a*值的影响（n=10）Table 2 Effect of different concentrations of rosemary extract on redness of prepared chicken steak (n= 10)

2.1.2 迷迭香提取物添加量对调理鸡排TBARS值的影响

图1 迷迭香提取物添加量对辣椒红调理鸡排TBARS值的影响（n= 5）Fig. 1 Effect of different concentrations of rosemary extract on TBARS value of prepared chicken steak (n = 5)

如图1所示，第0天时，不同处理组鸡排TBARS值之间没有显著差异；第40天时，添加迷迭香提取物处理组TBARS值显著低于空白组（P＜0.05），但不同迷迭香提取物添加量之间无显著差异（P＞0.05）；第80天，迷迭香提取物处理组的TBARS值显著低于空白组，添加量0.18、0.24、0.3 g/kg处理组间没有显著差异，但显著低于添加量0.06、0.12 g/kg处理组，说明当迷迭香提取物添加量为0.18～0.30 g/kg时，对调理鸡排的抗氧化效果较佳。综合不同迷迭香提取物添加量调理鸡排a*值和脂肪氧化值的变化，判定迷迭香提取物添加量为0.18 g/kg时最佳。

2.1.3 抗坏血酸添加量对调理鸡排a*值的影响

如表3所示，和空白对照组相比，添加抗坏血酸的处理组在贮藏过程中（包括初始值）保持显著高的a*值（P＜0.05）。抗坏血酸添加量为0.24 g/kg处理组的a*值最高，并且在第70天时显著高于其他处理组；0.06、0.12、0.18、0.30 g/kg处理组在整个贮藏期内没有显著差异，a*值介于空白对照组和0.24 g/kg处理组之间。

表3 抗坏血酸添加量对辣椒红调理鸡排a*值的影响（n=10）Table 3 Effect of different concentrations of ascorbic acid on redness of prepared chicken steak (n= 10)

2.1.4 抗坏血酸添加量对调理鸡排TBARS值的影响

图2 抗坏血酸添加量对辣椒红调理鸡排TBARS值的影响（n=5）Fig. 2 Effect of different concentrations of ascorbic acid on TBARS value of prepared chicken steak (n = 5)

由图2可知，随着贮藏时间的延长，不同处理组调理鸡排TBARS值均显著提高，抗坏血酸可不同程度地抑制鸡排贮藏过程中的脂肪氧化。第0天时，不同处理组间没有显著差异；第40天时，添加抗坏血酸处理组TBARS值显著低于对照组，但不同添加量处理组间无显著差异；第80天时，添加量0、0.06、0.12、0.18、0.24、0.3 g/kg处理组TBARS值分别提高27.5%、23.7%、25.5%、20.3%、19.0%、19.9%，添加量0.18、0.24、0.3 g/kg处理间没有显著差异，0.12 g/kg与0.06 g/kg间没有显著差异；随着抗坏血酸添加量的增加，脂肪氧化抑制率有显著提高，综合不同抗坏血酸添加量调理鸡排的a*值和脂肪氧化值的变化，判定抗坏血酸最佳添加量为0.24 g/kg。

2.2 响应面试验分析

利用Design-Expert 8.0.6软件中的中心组合试验设计，试验组合与结果如表4所示。

表4 响应面试验设计与结果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.1a*值回归模型分析

根据试验结果，拟合独立变量和响应值a*值的二次多项式方程：Y=-11.87+96.34A+186.23B+2.80AB-250.38A2-353.51B2。二次多项式模型R2值为0.932 0，校正系数R2Adj值为0.883 4，说明回归模型能解释93.20%响应值的变化，仅有总变异的6.8%不能用此模型解释。此模型精密度为13.306，说明该回归模型拟合结果良好。

如表5所示，回归模型F值为19.19，P＝0.000 6＜0.01，说明该模型极显著；失拟项F值为2.45，P＝0.203＞0.05，说明此模型建立有效。因此可用上述回归模型分析和预测迷迭香提取物和抗坏血酸对调理鸡排a*值影响的结果。调理鸡排a*值回归模型系数显著性结果显示，迷迭香提取物添加量的一次项A对a*值回归模型影响显著（P＜0.05），抗坏血酸添加量一次项B和二次项B2对a*值回归模型影响极显著（P＜0.01），迷迭香提取物添加量二次项A2以及和抗坏血酸添加量之间的交互项（AB）影响不显著（P＞0.05）。

表5 a*值回归模型方差分析Table 5 Analysis of variance for a* value

从图3可以看出，迷迭香提取物和抗坏血酸添加量对鸡排a*值的互作效应。鸡排a*值随迷迭香提取物添加量的增加而升高；当抗坏血酸添加量在0.216～0.264 g/kg范围时，鸡排a*值和抗坏血酸添加量成正比。图3显示，等高线偏向于圆形，也验证迷迭香提取物和抗坏血酸添加量间交互作用对鸡排a*值无显著交互效应（P＞0.05）。

图3 迷迭香提取物、抗坏血酸添加量及其交互作用对调理鸡排a*值影响的等高线和响应面图Fig. 3 Response surface and contour plots showing the interactive effect of rosemary and ascorbic acid and on redness of prepared chicken steak

2.2.2 TBARS值回归模型的分析

根据试验结果拟合独立变量和响应值TBARS值之间的经验联系，得到二次多项式方程：Y（TBARS值）=1.25-11.07A+2.03B-45.72AB+63.54A2+14.04B2。二次多项式回归模型的R2值为0.886 3，校正系数值为0.805 1，表示回归模型可以说明88.63%响应值的变化，其中总变异的11.37%不能解释此模型。此模型精密度为9.664，大于4.0，视为合理且拟合程度良好。

如表6所示，回归模型的F值为10.91，P值为0.003 3小于0.01，说明该模型极显著；失拟项F值为4.46，P值为0.091 2大于0.05，表示模型建立有效，因此可用该模型来预测和分析迷迭香提取物和抗坏血酸添加量对调理鸡排脂肪氧化的抑制作用。TBARS值回归模型系数的显著性结果表明迷迭香提取物添加量的一次项A对该模型影响极显著（P＜0.01），抗坏血酸添加量二次项B2对TBARS值回归模型影响显著（P＜0.05），一次项B、二次项A2以及二者交互作用AB对该模型影响不显著（P＞0.05）。

表6 脂肪氧化（TBARS值）的回归模型方差分析Table 6 Analysis of variance for TBARS value

如图4所示，TBARS值随着迷迭香提取物添加量的增加而减小；抗坏血酸添加量为0.216～0.245 g/kg时，TBARS值随着添加量的增加而减小，当添加量大于0.245 g/kg时，随添加量增大而增大。从图4等高线可知，迷迭香提取物和抗坏血酸添加量对鸡排TBARS值无显著互作效应（P＞0.05）。

图4 迷迭香提取物、抗坏血酸添加量及其交互作用对调理鸡排TBARS值影响的等高线和响应面图Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effect of rosemary and ascorbic acid on TBARS value of prepared chicken steak

2.3 响应值优化验证

利用软件Design-Expert 8.0.6，在迷迭香提取物、抗坏血酸添加量体系中，设定a*值最大、TBARS值最小，优化得出最佳试验参数：迷迭香提取物添加量0.198 g/kg、抗坏血酸添加量0.255 g/kg。将响应面法优化得到的组合设为实验组，单因素试验获得的最佳值设为对照组，测定其贮藏50 d后鸡排的a*值和TBARS值。如表7所示，响应面优化的最佳试验参数是可靠的。

表7 验证实验结果Table 7 Results of confirmatory experiments

3 结论与讨论

3.1 迷迭香提取物和抗坏血酸添加量对调理鸡排a*值的影响

有研究[15,18]报道迷迭香提取物可以显著提高辣椒红色素贮藏过程中的稳定性。Gomez等[18]向红肉中加入2 种不同类型的辣椒粉，每种辣椒粉中分别设置添加迷迭香处理组和空白组，结果发现2 种添加迷迭香提取物处理组的a*值均显著高于空白组；而辣椒红色素是辣椒粉呈红色的主要来源物质[19]，由此可判断迷迭香的添加可显著提高辣椒红色素的稳定性。本实验中添加迷迭香提取物可显著增加调理鸡排贮藏期间的a*值，但0.24、0.3 g/kg处理组调理鸡排的a*值下降速率高于0.18 g/kg处理组。Rohlik等[15]在研究辣椒红萨拉米香肠贮藏期间a*值的变化，结果发现添加量0.5 g/kg迷迭香提取物处理组在光照和黑暗条件下的a*值低于空白对照组，推测原因是由于迷迭香提取物添加量过高会促进辣椒红色素的降解，与本实验结果类似。

辣椒中的抗坏血酸成分对辣椒红色素的稳定性起到关键作用[20]；外源添加抗坏血酸对辣椒红色素稳定性的研究主要集中于辣椒粉制品中。Morais等[21]在辣椒粉中添加不同浓度的抗坏血酸，然后置于不同环境中贮藏，结果显示添加抗坏血酸可显著保持辣椒粉中辣椒红色素含量的稳定，且作用强度和抗坏血酸浓度成正比。Shin等[22]研究发现向鸡肉肠中加入0.02%抗坏血酸可显著增加其贮藏期间的a*值。抗坏血酸主要是通过AscH-为自由基提供电子供体而起到清除自由基的作用[23]，但pH值大小对AscH-活性影响显著，当酸性过高，大多数抗坏血酸以AscH2形式存在，从而大大降低其抗氧化性。本实验中0.24 g/kg处理组调理鸡排a*值的稳定性大于0.3 g/kg处理组，可能是由于抗坏血酸添加量过高，鸡排表面腌制液成分酸性偏高，导致对辣椒红色素的抗氧化性减弱，保护色素稳定性能力降低，也有类似研究[24]报道抗坏血酸添加过量会引起pH值下降而引起产品褪色，具体作用机理需要进一步进行验证。

3.2 迷迭香提取物和抗坏血酸添加量对调理鸡排TBARS值的影响

迷迭香提取物抑制肉中脂肪氧化的机理主要包括以下2 种作用方式：一是迷迭香提取物中的迷迭香酚、迷迭香酸以及鼠尾草酸等成分能代替氧自由基和不饱和脂肪酸结合，从而抑制肉品中脂肪发生氧化反应[25-26]；二是迷迭香提取物中的酚类物质如迷迭香酚可通过螯合金属离子而阻断自由基与不饱和脂肪酸的反应链，避免脂质氧化[27]。本实验结果显示当迷迭香提取物添加量为0.18～0.3 g/kg时，抑制鸡排氧化效果最好且没有显著差异。Rohlik等[11]在蒸煮香肠中添加0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 g/kg迷迭香提取物，结果发现当迷迭香提取物添加量为0.2～0.3 g/kg时，抗氧化效果最佳且没有显著差异，与本实验研究结果相似。贾娜等[28]研究迷迭香提取物对牛肉丸贮藏过程中TBARS值的影响，结果发现，冻藏30 d后，迷迭香添加量为0.02%～0.04%时，牛肉丸TBARS值没有显著差异；第60天时0.04%处理组显著低于0.02%处理组。而李婷婷等[29]研究大黄鱼经不同添加量迷迭香提取物浸泡处理后，发现迷迭香添加量0.1%、0.2%、0.3%处理组均可显著抑制鱼肉脂肪氧化，且不同添加量处理组间没有显著差异。不同肉类的脂肪含量和差异较大，迷迭香添加量对其影响规律也不完全一致。

抗坏血酸具有抗氧化性能，但它既可以作为抗氧化剂，又可作为促氧化剂，这取决于其浓度、金属离子存在和生育酚含量[30]。Sánchez-Escalante等[31]探究天然抗氧化剂对牛肉饼贮藏期的品质变化中发现，单独使用抗坏血酸时，没有表现出显著抗氧化性，当其和迷迭香提取物混合使用时可显著降低牛肉饼的抗氧化性。Mitsumoto等[32]向碎牛肉中加入500 mg/kg抗坏血酸可以抑制脂质过氧化；相反，Benedict等[33]实验发现50 mg/kg抗坏血酸加入到牛肉中可以增加脂质过氧化。本实验结果发现，抗坏血酸添加量在0.3 g/kg内可抑制脂质氧化，且和迷迭香提取物共同使用时对TBARS值变化没有显著交互作用。

本实验将不同添加量迷迭香提取物和抗坏血酸添加到鸡排中，a*值和TBARS值作为响应值，应用中心组合试验拟合得到2 个二次多项式模型，准确反映各影响因子和响应值之间的函数关系，2 个模型的决定系数R2分别为0.932 0、0.886 3，拟合度高，结果更为准确可靠。优化得到有效抑制鸡排贮藏过程中的脂肪氧化和褪色速率的最佳抗氧化剂复配比，即迷迭香提取物添加量0.198 g/kg、抗坏血酸添加量0.255 g/kg。在此工艺条件下，测得调理鸡排a*值为21.88，TBARS值为0.59 mg/kg，与拟合结果一致。该工艺条件下制作的调理鸡排在贮藏过程中a*值的稳定性较如今工业化生产有显著提高，脂肪氧化速率显著下降，有效保持产品的商业价值，为调理鸡排工业化生产贮藏颜色和脂肪氧化的稳定性提供理论依据。