稀土镧和铈对大豆蛋白质含量和氨基酸组成的影响及营养评价

任红玉，李昊阳，陈海燕，白 露，苗艳丽，陶 佩，刘文龙，张兴文,*

（1.东北农业大学资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.哈尔滨工业大学化工与化学学院，黑龙江 哈尔滨 150001）

豆科植物中，大豆最富有营养而又易于消化，富含8 种人体必需氨基酸（essential amino acids，EAA）。大豆蛋白消化率和蛋白质功效比值较高，生物学价值平均含有96 个标准单位，与牛奶、牛肉、鸡蛋接近，属于全价植物蛋白[1-2]。大豆在常被食用的十余种豆类中，大豆拥有“豆中之王”、“田中之肉”、“绿色的牛乳”等美誉[3]，是膳食指南中规定的中国居民每天都该摄入的食物之一。大豆籽粒中EAA的组成影响着蛋白质的品质[4]，现代营养学理论认为，食物蛋白质中EAA的组成比例越接近人体EAA的组成，越容易被吸收，其营养价值也越高[5]。合理调控大豆籽粒的营养价值，使其更适合人体营养需求，对提升中国大豆市场竞争力具有重要的社会、经济和战略意义。

目前，转基因食品安全性及环境影响结论未定[6]，因此通过非转基因手段改良大豆品质及提高产量具有重要的现实意义。我国稀土农用技术起源于20世纪70年代，已在粮食、水果、蔬菜等作物上得到了广泛的应用，并带来了显著的社会与经济效益。稀土具有生理活性，适量的稀土元素可以促进植物种子萌发、提高出苗率、促进扦插植物生根[7]，增强植物抗逆能力和抗病性[8-9]，增加植物叶绿素含量、提高植物光合速率[10]。稀土在促进作物增产[11]与改善作物品质[12]方面的作用已被证实。目前已有通过不同方法调控大豆氨基酸组分的研究。蒋涛等[13]的研究发现，通过套作种植的方式使大豆具有与净作大豆一致甚至更高的氨基酸营养价值。马艳弘等[14]的研究表明，喷施外源硒可以提高发芽大豆中含硫氨基酸及组氨酸和赖氨酸的含量，氨基酸配比更加平衡，提高了大豆蛋白的营养价值。也有研究表明高温[15]、灌水[16]、施肥[17]等会对不同作物氨基酸组分含量产生影响。而稀土对大豆籽粒的氨基酸组分及营养价值影响的研究还鲜见报道。

迄今为止，许多蛋白质营养价值评价方法，如：联合国粮食与农业组织（Food and Agriculture Organization，FAO）/世界卫生组织（World Health Organization，WHO）提出的蛋白质营养价值评价的EAA模式，氨基酸比值系数分（score of ratio coefficient of amino acid，SRCAA）、化学分析方法、生物价、蛋白质消化率校正氨基酸评分（amino acid score，AAS）等，已广泛应用到相应食用原料蛋白质氨基酸的营养评价中，为合理评价食品营养价值提供了理论依据。本课题组系统研究了稀土对大豆产量和品质的影响，前期研究表明无论是大田实验还是盆栽实验，喷施适宜浓度的稀土镧、铈溶液都能提高大豆籽粒的蛋白质含量。本实验以东北非转基因优质大豆为研究对象，采用稀土农用技术调控非转基因大豆的品质，并通过测试不同处理大豆的氨基酸组分含量，分析和评价大豆籽粒蛋白质的营养价值，以期充分挖掘我国稀土农用技术，为提高大豆原料的营养价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验于2017年在东北农业大学园艺实验站进行。大豆品种为东农52，由东北农业大学大豆研究所提供，采用盆栽法，盆高30 cm，上口直径35 cm，下口直径25 cm。每盆装土17.5 kg，每盆播种籽粒饱满、大小一致的种子8 颗，待苗长至5～8 cm时，定苗4 株，常规管理。实验用土取自东北农业大学园艺实验站黑土，土壤的基础理化性质为：有机质27.4 g/kg、pH 7.06、全氮3.58 g/kg、全磷1.08 g/kg，碱解氮、速效磷和速效钾含量分别为138、55 mg/kg和194 mg/kg。每盆施用尿素0.44 g、磷酸二铵1.22 g、硫酸钾1.25 g。

CeCl3·7H2O（分析纯，纯度≥99.0%）、La2O3（分析纯，纯度≥45.0%） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

L-8800全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；Infratec 1241近红外谷物分析仪 丹麦FOSS公司；DHG-9141A恒温干燥箱 杭州汇尔仪器设备有限公司；RT-02型粉碎机 北京开创同和科技有限公司；DZF-6020真空干燥器 上海精宏实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验设计

在大豆苗期（第3节复叶充分展开的植株达一半以上，6月23日）和初花期（主茎上任何节出现花朵，7月4日），用喷雾器将质量浓度为100、150、200 mg/L的LaCl3溶液（分别用La10、La15、La20表示）和质量浓度为30、60、90 mg/L的CeCl3溶液（分别用Ce3、Ce6、Ce9表示）以及质量浓度为40、60、70 mg/L的LaCl3+CeCl3混合溶液（分别用LC4、LC6、LC7表示）分别均匀喷洒于全部大豆叶片的正、反面，滴液为限（苗期每盆约150 mL，花期每盆约300 mL），对照（CK）喷等量蒸馏水，每个处理设3 个生物学重复。

1.3.2 指标测定方法

采用Infratec1241近红外谷物分析仪测定大豆成熟期籽粒蛋白质含量。准确称取待测样品（30±5） mg，以6 mol/L HCl溶液进行酸水解后，使用L-8800全自动氨基酸分析仪测定氨基酸含量，按照NY/T 56—1987《谷物籽粒氨基酸测定的前处理方法》标准执行。结果以干质量计。

1.3.3 蛋白质营养评价方法

AAS、化学评分（chemical score，CS）、必需氨基酸指数（essential amino acid index，EAAI）、SRCAA参考文献[18]计算。

1.4 数据处理

使用SPSS 17.0软件中单因素分析（ANOVA）多重比较的方法，对不同处理之间的蛋白质含量、氨基酸含量及各营养价值评分进行差异显著性分析。利用Excel 2007软件对相应数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 镧和铈对大豆籽粒蛋白质含量的影响

表1 镧、铈处理对大豆籽粒蛋白质含量的影响Table 1 Effects of lanthanum and cerium on protein content in soybean seeds

在大豆的苗期和初花期，每个处理叶面喷施稀土溶液各1 次后，测定成熟期大豆籽粒中蛋白质含量，如表1所示。除La20处理样品的蛋白质含量与CK差异不显著，其余所有处理组的蛋白质含量均显著高于CK。大豆籽粒蛋白质含量随着稀土质量浓度的变化而变化，其顺序依次为Ce9＞Ce3＞Ce6、La10＞La15＞La20、LC6＞LC7＞LC4，在LC6处理下蛋白质质量分数达最高为42.93%，较CK增加5.17%，上述结果表明在目前质量浓度范围下，喷施稀土镧、铈溶液均可以提高大豆籽粒蛋白质含量，但稀土镧质量浓度过高时蛋白质含量有下降的趋势。

2.2 稀土处理样品的氨基酸组成

表2 稀土镧、铈处理下大豆籽粒氨基酸组分及含量变化Table 2 Amino acid composition of control soybean seeds and those treated with CeCl3 and LaCl3mg/g

本实验检测到除色氨酸外共17 种氨基酸，由于待测样品经6 mol/L HCl溶液进行酸水解处理，而色氨酸在酸性溶液中水解时易被破坏，因此样品中未检测到色氨酸。不同处理后样品氨基酸含量的变化如表2所示，各质量浓度稀土处理氨基酸含量均为蛋氨酸含量最低，谷氨酸含量最高。处理组中EAA的含量，在LC7处理下的苯丙氨酸较CK显著升高，而在Ce9处理下的亮氨酸、赖氨酸及异亮氨酸的含量却较CK显著降低，且EAA总量较CK显著降低5.37%，其他处理组中各EAA含量及总量较CK均无显著差异。

从NEAA的组分来看，在所有质量浓度的稀土铈和混合稀土溶液处理下天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸的含量较CK均显著降低，而在稀土镧溶液处理下这3 种氨基酸的含量较CK无显著变化。在除La10外的所有实验组中谷氨酸、丙氨酸及脯氨酸的含量均较CK显著降低，且在所有氨基酸中谷氨酸含量较CK的降幅最多，降幅8.71%～14.32%（除La10外）。精氨酸含量在稀土铈及LC4处理下较CK均显著降低。胱氨酸、酪氨酸及组氨酸的含量较CK变化不明显。除La10外，各实验组NEAA的总量均显著低于CK，其中在Ce9处理下最小，较CK降低11.89%。

经过稀土溶液处理后TAA含量除La10处理外其他各组较CK均显著降低，并在Ce9处理下降幅最大，达9.74%，而EAA/TAA和EAA/NEAA的值除La10处理外，其他各实验组较CK均显著增加。在单一铈溶液处理下EAA/TAA和EAA/NEAA的值随着处理质量浓度的升高先增加后降低，在单一镧溶液处理下随质量浓度的升高而递增，在混合稀土溶液处理下质量浓度的升高先降低后增加，其中在LC7处理下分别达最高，较CK分别显著增加6.35%、9.80%。结果表明叶面喷施稀土对大豆籽粒EAA/TAA和EAA/NEAA值具有一定的调节作用。

2.3 不同处理组大豆营养评价

2.3.1 EAA的组成比较

表3 稀土镧、铈处理下大豆籽粒蛋白中EAA的含量变化Table 3 Essential amino acid composition of control soybean seeds and those treated with CeCl3 and LaCl3 mg/g

由于采用凯氏定氮法评测粗蛋白质含量时，会将一些非蛋白质含氮物质，如色素（叶绿素和藻红蛋白）、核酸、游离氨基酸和其他无机氮化合物都算作总蛋白含量的一部分，因此测定的值会高于真实蛋白质水平。因此本实验利用氨基酸总量作为蛋白质总量进行分析和计算，使结果更准确地反映样品的营养价值[19-20]。

依据氨基酸平衡理论，当氨基酸组成比例越接近WHO/FAO模式谱或卵清蛋白模式谱比例时，蛋白质的质量就越优。以WHO/FAO模式中的氨基酸值为参考[21]，如表3所示，对照组中除了蛋氨酸+胱氨酸、缬氨酸、苏氨酸含量低于WHO/FAO模式中相应氨基酸含量外，其他EAA含量均高于WHO/FAO模式值。经稀土处理后（除La10外），亮氨酸的含量较CK均显著升高，在LC7处理下达最大值（83.16 mg/g），较CK增加6.45%，与卵清蛋白模式值相接近。在Ce6、Ce9、LC4、LC7处理下缬氨酸含量（50.19～51.89 mg/g）优于WHO/FAO模式值（50 mg/g），且在Ce9处理下达最大值，较CK增加14.50%。各组中赖氨酸的含量均与卵清蛋白模式值（70 mg/g）相接近，在Ce3、La15、La20处理下含量显著高于CK，且在La20处理下达最大值，较CK增加5.40%。除La10外，各实验组苯丙氨酸+酪氨酸的含量较CK均显著增加，且在混合稀土处理下增幅最大，接近卵清蛋白模式值（93 mg/g），其中在LC6处理下含量最为接近（92.47 mg/g）卵清蛋白模式值，但从含量来说在LC7处理下达最大值（97.04 mg/g），较CK增加16.41%。

从EAA总含量来看，各实验组（除La10外）总含量均显著高于CK。且随着稀土铈溶液质量浓度的升高，先升高后降低；随着稀土镧与混合溶液质量浓度的升高而递增，且3 种稀土溶液分别在Ce6、La20、LC7处理下达最大值403.33、400.62、408.03 mg/g，均高于WHO/FAO模式中EAA的总值（350 mg/g）。其中LC7处理下较CK增加6.59%，由此看来，在目前质量浓度条件下稀土铈与混合稀土对籽粒蛋白质中EAA总含量的提升要优于稀土镧。

综上所述，经适宜质量浓度稀土处理后可以提高大豆蛋白中除了蛋氨酸+胱氨酸和异亮氨酸以外的EAA的含量及EAA总含量。由于蛋白质的营养价值不仅取决于氨基酸种类是否齐全及EAA绝对含量的高低，更重要的是氨基酸组成比例越接近人体蛋白组成，其蛋白质量越高[22]。因此以WHO/FAO模式值和卵清蛋白模式值为标准，通过AAS、CS、EAAI及SRCAA，可以更直观反映稀土对大豆籽粒蛋白营养价值水平的调控能力。

2.3.2 AAS结果

表4 稀土镧、铈处理下大豆蛋白的AASTable 4 Amino acid scores of protein in soybean seeds treated with CeCl3 and LaCl3

如表4所示，AAS小于100为限制氨基酸，其中评分最低的为第1限制氨基酸[23]。各组中除了La10第1限制氨基酸为缬氨酸外，其他处理均为蛋氨酸+胱氨酸。在Ce6、Ce9、LC4、LC7处理下只存在1 种限制氨基酸。CK、Ce3、La10、La15、La20、LC6存在第2限制氨基酸，且除La10为蛋氨酸+胱氨酸外，其他组均为缬氨酸，其中，CK和La10存在第3限制氨基酸为苏氨酸。稀土铈处理组中AAS均高于CK，且AAS随着质量浓度升高先增后降。稀土镧处理组中AAS均低于CK，且AAS随着质量浓度升高递减。在混合稀土处理组中AAS只在高质量浓度为70 mg/L LaCl3+CeCl3处理下低于CK，且AAS随着质量浓度的升高递减。其中，在Ce6处理下AAS最高为94.05，较CK增加了4.43。在LC7处理下AAS最低为86.37，较CK降低了3.25。基于AAS来看，在目前质量浓度梯度下施用单一稀土铈和镧铈稀土混合施用更利于蛋白质营养价值的提升，而喷施稀土镧则降低了大豆蛋白的营养品质，这表明稀土元素的种类不同对大豆蛋白品质的调控效果存在着一定的差异性。

2.3.3 CS结果

表5 稀土镧、铈处理下大豆蛋白的CSTable 5 Chemical scores of protein in soybean seeds treated with CeCl3 and LaCl3

以卵清蛋白模式为标准，CS越接近100说明样品蛋白质的质量越优，低于100为限制氨基酸。由表5可知，各处理样品的第1限制氨基酸均为蛋氨酸+胱氨酸，与AAS中的结果相似。在各实验组第1限制氨基酸的CS中，La10的CS最高为71.28，LC7的CS最低为61.49。氨基酸的CS是蛋白质中某一EAA的相对含量与参考蛋白模式中相应EAA相对含量的接近程度，各组中蛋氨酸+胱氨酸含量变化不显著，而La10与CK蛋白质中EAA氨基酸总含量最低（表3），导致其CS较高。CS随着不同稀土溶液质量浓度的变化趋势与AAS的结果相一致。

2.3.4 SRCAA结果

表6 稀土镧、铈处理下大豆蛋白的氨基酸比值系数及SRCAATable 6 RC and SRCAA of protein in soybean seeds treated with CeCl3 and LaCl3

以FAO/WHO模式为标准，根据样品中EAA含量计算SRCAA，可以更客观地反映样品的营养价值。氨基酸比值系数值越接近1，SRCAA越接近100，则表明样品中氨基酸组成比例与标准模型越接近[24]。由表6可知，各组中除La10的第1限制氨基酸为缬氨酸外，其他处理均为蛋氨酸+胱氨酸，这与AAS计算的结果相一致。在Ce6、Ce9、La10处理下SRCAA均高于CK。其中在Ce6处理下最高达84.08，在LC7处理下最低为78.38。SRCAA随着稀土铈质量浓度的升高，先升后降；随着稀土镧和混合稀土溶液质量浓度的升高而递减。SRCAA随稀土溶液质量浓度的变化趋势与AAS和CS的趋势一致。

2.3.5 EAAI测定结果

图1 稀土镧、铈处理下大豆蛋白的EAAI变化Fig. 1 EAAI of protein in soybean seeds treated with CeCl3 and LaCl3

EAAI反映了蛋白质中EAA组成的平衡程度，EAAI越接近100，样品蛋白与参照蛋白的EAA组成越接近，营养价值越高。如图1所示，在稀土镧、铈处理下，各实验组EAAI（78.29～82.46）均高于CK（78.26）。在不同稀土处理下EAAI的变化顺序分别为Ce6＞Ce3＞Ce9、La20＞La15＞La10、LC4＞LC7＞LC6。其中在Ce6处理下EAAI最大，在La10处理下EAAI最小，且稀土铈和混合稀土处理组的EAAI要明显高于稀土镧组。

3 讨 论

早在二十世纪七十年代，我国稀土农用作为科研推广项目，施用一定量的稀土能起到使农作物提高产量、改善品质的作用，我国稀土农用技术获得了广泛认可。由倪嘉缵院士主持的“稀土农用的环境化学行为及生态、毒理效应”研究表明[25]：如稀土施用量达到我国稀土农用目前用量，即每1/15 hm2施用15～60 g，连续施用500 次，对土壤理化性质及肥力供应不会造成显著影响。另外，稀土元素主要集中于作物的根部，不易迁移，果实中的含量甚微。前人通过对稀土毒性的研究、稀土放射性的测定、稀土土壤残留量的分析发现：按我国稀土农用剂量要求来算，不会造成农产品的放射性污染，也不会造成环境的污染[26-28]，通过喷施适宜稀土改善作物品质是相对安全的。稀土对植物生长有“低促高抑”的作用[29]，较高质量浓度Ce（III）（60～150 mg/L）对叶绿素含量具有抑制作用[30]，且高浓度的稀土溶液不利于蛋白质的积累[31]，因此喷施稀土叶面肥应注意浓度的筛选，若使稀土农用达到最大效应，仍需系统深入研究并制定相应稀土农用的使用规范。

在本实验所设质量浓度梯度条件下，所有实验组蛋白质含量均较CK显著增加，在高质量浓度的镧（La20）和混合稀土（LC7）处理下蛋白质含量开始呈下降趋势。在氨基酸组分的研究中发现，与CK相比除La10外各实验组EAA/TAA值均高于CK，其中在LC7处理下占比最高，较CK显著增加6.35%。但TAA含量除La10处理外其他各组较CK均显著降低。国内外关于氨基酸组分与蛋白质含量关系的研究较多，但结论不统一[32-33]。而笔者认为不同氨基酸在构成蛋白质的同时，氨基酸之间也存在互相转化和动态变化，不应只是通过氨基酸组分与蛋白质含量的直接影响，简单判断其相关性[34]。本实验经稀土处理后样品的谷氨酸含量较CK降幅明显（表2），谷氨酸不仅为绝大部分氨基酸的生物合成提供氨基，还用来合成细胞中的其他含氮化合物，如叶绿素、光敏色素等卟啉类化合物[35-36]，施用稀土后光合作用的增强，植物体内叶绿素含量增多[10,30]，因此将消耗更多的谷氨酸，而谷氨酸含量的下降也可能会间接导致其他氨基酸含量的降低。但有关稀土调控大豆品质的内在机制目前还不明晰，后续研究还应结合差异蛋白质组学的相应实验，来揭示稀土对不同功能蛋白表达丰度的影响规律。

本实验以FAO/WHO模式为参考标准，分析施用稀土后大豆籽粒EAA含量，结果表明其值均接近或超过FAO/WHO模式中相应氨基酸含量，且除La10外，苯丙氨酸+酪氨酸、亮氨酸含量较CK显著升高，与卵清蛋白模式值相接近。为了更直观反映样品间的营养价值水平，对样品进行了一系列基于化学分析方法的评分。其中，在60 mg/L CeCl3处理下，AAS（94.05）、SRCAA（84.08）、EAAI（82.46）均为高于CK及各处理组，且发现AAS、CS及SRCAA都有随着稀土铈质量浓度的升高，先升后降，随着稀土镧和混合稀土溶液质量浓度的升高递减的趋势，在高质量浓度混合稀土溶液LC7处理下AAS（86.37）、CS（61.49）、SRCAA（78.38）均为实验组中最小，且低于CK。马艳弘等[14]的研究也表明，在12 μg/mL的外源硒处理下的发芽大豆蛋白质的营养价值评分最高，而质量浓度继续升高后评分降低。这也与前人得出的稀土的“剂量-效应关系”相似，即不同剂量稀土作用于微生物[37]、植物[38]、动物[39]均存在的Hormesis效应。综上所述，喷施适宜质量浓度的稀土溶液，大豆蛋白质中氨基酸的配比可更加合理，营养价值得到了改善，可为大豆制品加工提供优质蛋白原料。但采用稀土调控大豆籽粒蛋白品质时也应考虑其施用的剂量效应。

4 结 论

稀土农用可提高大豆蛋白质含量与EAA/TAA值，使得氨基酸各组分配比更加接近氨基酸标准模型比例，且不同稀土元素对大豆蛋白氨基酸组分的调控作用存在差异性。在60 mg/L CeCl3处理下，AAS（94.05）、SRCAA（84.08）、EAAI（82.46）的评价指标数值均高于CK和其他各处理组，理论上可以采用稀土调控的方法改善大豆蛋白的营养价值，为大豆制品加工提供优质蛋白原料。