pH 值对低酯果胶/酪蛋白酸钠复合体系流变及结构特性的影响

彭媛媛，王昱圭，汤雪纤，赵 欣，张甫生，郑 炯,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.食品科学与工程国家级实验教学示范中心（西南大学），重庆 400715；3.重庆第二师范学院，重庆市功能性食品协同创新中心，重庆 400067）

食品体系的功能特性由多糖、蛋白质、脂类及其他生物大分子共同决定[1]。由于多糖在一定程度上能修饰蛋白质的微观结构和功能性质，改善单一蛋白质在等电点附近失稳聚沉现象，故多糖和蛋白质在很大程度上影响着食品体系的微观结构、稳定性和质地[2]。近年来，多糖和蛋白质的相互作用已广泛应用于食品工业中，如新型凝胶[3]、乳液稳定[4]和微胶囊[5-6]等。但蛋白质和多糖间的作用主要由静电力驱动，故pH值会影响其相互作用，大多数多糖/蛋白质复合体系对pH值环境条件变化表现出较强的敏感性[7]。因此，研究多糖/蛋白质复合体系在不同pH值下发生的结构和性质变化对其在不同pH值食品体系中的应用具有重要意义。

Yuan Yang等[8]发现，在pH 5.5和pH 6.0时壳聚糖和大豆球蛋白复合体系均能形成微凝胶网络结构，但体系只在pH 5.0时具有较好的凝胶网络结构。牛付阁等[9]发现随着pH值的变化阿拉伯胶/卵白蛋白复合溶液呈现出4 个不同的相区（共溶区、可溶性复合物相区、不溶性复合物相区、共溶区）。Turgeon等[10]也发现，不同pH值条件下黄原胶和β-乳球蛋白相互作用是不同的，随着pH值降低到β-乳球蛋白等电点以下，体系由溶胶转化为凝胶网络结构，故在不同pH值下复合体系结构是有差异的。李成倍[11]发现在pH 4.0～4.2时高酰基结冷胶与酪蛋白酸钠通过络合作用逐渐形成共聚体，凝胶网络结构增强。酪蛋白酸钠（sodium caseinate，SC）是由酪蛋白碱处理得到的一类可溶性蛋白质[12]，常作为增稠剂、乳化剂和稳定剂广泛应用于食品行业中[13-14]。但SC在酸性条件下失稳聚沉的现象制约其应用。水解桃胶[15]、羧甲基纤维素[16]、海藻酸钠[17]等高分子质量水溶性多糖的添加，可对SC进行改性修饰，并改善其功能特性，使其具有更广泛的应用前景。低酯果胶（low methoxyl pectin，LMP）作为一种水溶性多糖，具有良好的食用功效，且在较广的pH值范围（pH 2.0～6.0）内具有较好的凝胶性能[18]。在酸性条件下，带有较多负电荷的LMP，可以吸附在蛋白质表面，并能通过静电作用和空间位阻作用稳定体系[19-20]。因此向SC溶液体系中加入适量LMP，能提高体系在酸性条件下的稳定性。

目前关于pH值影响多糖/蛋白质复合体系结构性质的报道较多，但针对LMP/SC复合体系在不同pH值下流变及结构特性的系统研究较少。因此，本实验以LMP/SC复合体系为研究对象，在不同酸性条件下（pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）研究其流变特性、Zeta电位、粒径、浊度及微观结构的变化，明确相关特性与pH值环境条件的关系，以期为不同酸性条件下LMP/SC复合体系在食品工业中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

LMP（食品级，酯化度20%） 河南恒锐食品生物科技有限公司；SC（食品级，蛋白质量分数98%）上海极威生物科技有限公司；柠檬酸（分析纯） 成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

FA2004A电子分析天平 上海精天电子仪器有限公司；pHS-3C酸度计 成都世纪方舟科技有限公司；AR-G2旋转流变仪 美国TA公司；2100AN浊度仪美国Hach公司；Nano-ZS & MPT-2 Zeta电位及纳米粒度仪英国Malvern公司；JSM-6510LV钨灯丝扫描电子显微镜日本电子株式会社。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

参考牛付阁[9]和邱蓉[21]等的方法稍有改动，在100 mL蒸馏水加入1 g SC和0.5 g LMP，80 ℃加热60 min，加热过程不断搅拌，使体系充分水化溶解后静置冷却。用不同质量浓度柠檬酸（5、12.5、25、50 g/100 mL）调节体系pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，确保柠檬酸对溶液的稀释作用最小。然后在4 ℃冰箱静置24 h后进行测定。

1.3.2 流变特性的测定

样品处理：参考刘丽娅[22]的方法稍做改动。采用平板-平板测量系统，平板直径40 mm，设置间隙1.0 mm，取适量样品于平行板，除去多余样品，并用硅油密封表面以防止水分蒸发。每个样品测试前保留时间180 s，测量温度25 ℃。

静态流变学测定：设置剪切速率从0.1～300 s-1递增后，再从300～0.1 s-1递减，测定过程中剪切应力及黏度的变化情况。采用Herschel-Bulkey模型（下式）对所得数据点进行回归拟合，拟合系数R2表示方程拟合精度。

式中：σ为剪切应力/Pa；K为稠度系数/（Pa·sn）；γ为剪切速率/s-1；n为流体指数；σ0为屈服应力/Pa。

动态黏弹性测定：控制扫描应变值0.5%，确保测定过程在样品线性黏弹区内进行，振荡频率0.1～10 Hz，测定不同样品储能模量（G′）、损耗模量（G”）以及损耗正切角（tanδ）随角频率的变化情况。

1.3.3 粒径的测定

将待测样品用蒸馏水稀释1 000 倍后，用柠檬酸溶液调节体系pH值与稀释前一致。采用纳米粒度仪测定其粒径大小。平衡时间2 min，测定温度25 ℃，所用光源为最大输出功率10 W的He-Ne激光，检测角90°，检测波长633 nm。避免多重光散射，每次循环扫描10～120 次，每个样品重复测量3 次。

1.3.4 Zeta电位的测定

将待测样品用蒸馏水稀释1 000 倍后，用柠檬酸溶液调节体系pH值与稀释前一致。采用纳米粒度仪测定不同条件下LMP/SC复合体系的Zeta电位。测定条件：折叠毛细管样品池，0.45 cm2铂电极，折叠毛细管间距0.4 cm。平衡时间2 min，测定温度25 ℃。每次循环扫描10～100 次，每个样品重复测量3 次。

1.3.5 浊度的测定

采用浊度仪测定：开机预热30 min之后对仪器进行标定校准，缓慢注入50 mL待测液于样杯中，盖上样杯盖，用滤纸擦净杯体后将其平稳置入比色池，关闭池盖。待显示数据稳定，读出样品浊度值，每个样品重复测量3 次。

1.3.6 微观结构的测定

将制备好的样品倒入培养皿中，使样品均匀平铺在培养皿内，放入冰箱冻藏24 h，使样品完全结冰。再放入真空冷冻干燥机中，于-50 ℃进行抽真空冷冻干燥72 h，使得样品完全干燥。将干燥后的样品固定在双面导电样品台上，利用离子溅射仪使样品具有导电性。使用扫描电子显微镜在500放大倍率下，对样品的微观结构进行观察，并选择具有代表性的视野进行记录拍照。

1.4 数据处理

所得数据使用Origin 8.0和Microsoft Excel绘制相关图表。粒径、Zeta电位、浊度数据使用SPSS 20对其进行方差分析（ANOVA），利用邓肯式多重比较对差异显著性进行分析（P＜0.05，差异显著；P＜0.01，差异极显著）。每次测试前需更换样品，且每组实验均重复3 次。

2 结果与分析

2.1 pH值对复合体系流变学特性的影响

2.1.1 静态剪切流变学特性

由图1可知，复合体系剪切应力随剪切速率的增大而增大，最后趋于平缓，呈现出剪切稀化的流体特征。在低剪切速率时，由于单位体积中大分子缠绕碰撞几率比外力引起的缠结断裂的几率大，体系黏度此时较大；随着剪切速率的增大，分子交联结构受到破坏，体系黏度也随之减小[23]。在pH 3.0～4.0时，体系剪切应力随pH值的增大而减小；在pH 4.0～4.5时，体系剪切应力出现骤增；在pH 4.5～5.5时，体系剪切应力又随pH值的增大而减小，且在pH 5.5时最小。

图1 不同pH值下LMP/SC复合体系剪切应力随剪切速率变化曲线Fig. 1 Shear stress vs. shear rate curves of LMP/SC composite system at different pH values

由表1可知，拟合曲线决定系数R2均大于0.99，故模型精度较高。流体指数n代表流体假塑性程度，n值偏离1的程度越大，表明体系越容易剪切变稀，即假塑性程度越大[24]。结果表明，n值均小于1，屈服应力σ0大于0，表明在剪切速率范围内，体系呈现出有屈服值的剪切变稀非牛顿流体特性[25]。稠度系数K反映体系黏稠程度，结果表明：在pH 3.0～4.0时，随着pH值的增大，K值减小，n值增大，体系表观黏度减小；在pH 4.0～4.5时，K值和σ0值出现骤升，n值出现骤降，体系表观黏度骤增，剪切变稀现象进一步增强，假塑性流体行为也更加明显[26]；在pH 4.5～5.5时，随着pH值的增大，K值下降，n值增大，复合体系表观黏度进一步减小。总体上，随着pH值的增大，复合体系表观黏度呈现出先减小，在SC等电点附近骤增，然后继续减小的趋势。

表1 LMP/SC复合体系Herschel-Bulkey方程拟合参数Table 1 Herschel-Bulkey equation fi tting parameters for LMP/SC composite system

2.1.2 动态黏弹流变学特性

tanδ反映G”与G′的比值，G′代表储存在复合体系中的能量，反映体系弹性大小，G”代表体系由于不可逆黏性形变损耗的能量大小，反映体系黏性大小[24]。故tanδ反映体系黏性和弹性对LMP/SC复合体系黏弹性质的相对贡献，tanδ小说明体系处于类似固体的状态，流动性相对差，tanδ大则表明体系呈现类似液体的状态，流动性较大，而复合体系大部分tanδ大于1，说明体系显现出黏性为主的液体特性[27]。由图2a可知，随pH值的增大，体系tanδ呈现出两段变化：在pH 3.0～4.0时，tanδ随着pH值的增大而增大，复合体系流动性增强；在pH 4.5～5.5时，tanδ骤减后随pH值的增大进一步增大。由图2b可知，体系的G”也呈现两段变化：在pH 3.0～4.0时，G”随pH值的增大而减小；在pH 4.5时，G”出现骤增，此时体系黏性最大；在pH 4.5～5.5时，随着pH值的增大，G”减小幅度更大，体系黏性减小更多。复合体系黏性在SC等电点（pH 4.5）附近会发生突变，且在pH值高于SC等电点后，pH值变化对体系流体特性的影响更大。

图2 LMP/SC复合体系tanδ（a）和G”（b）随频率变化曲线Fig. 2 tanδ (a) and loss modulus (b) vs. frequency curves of LMP/SC composite system

2.2 pH值对复合体系Zeta电位及粒径的影响

Zeta电位代表体系内微粒的平均电位，可衡量多糖/蛋白质复合物表面的电荷密度变化[28]，粒径代表体系内微粒大小，两者均能反映体系的稳定性。在不同pH值条件下，体系Zeta电位和平均粒径均存在显著性差异（P＜0.05）。由图3A、B可知，随着pH值的增大，复合体系粒径先增大后减小，且在pH 4.5时最大；复合体系Zeta电位随着pH值的增大而减小，当pH 4.5～5.5时，Zeta电位由正值减小为负值。而Zeta电位绝对值先减小后增大，表明复合体系稳定性先减小后增大。LMP/SC复合体系在SC等电点（pH 4.5）附近结构特性发生突变，这与流变学特性的测定结果相一致。

图3 不同pH值下复合体系Zeta电位（A）及粒径（B）的变化Fig. 3 Changes in zeta potential (A) and particle size (B) at different pH values

2.3 pH值对复合体系浊度的影响

图4 不同pH值下复合体系的浊度（A）和样品图（B）Fig. 4 Turbidity (A) and visual appearance (B) of composite system at different pH values

浊度表征光散射对入射光的衰减，反映溶液对光线通过时所产生的阻碍程度，浊度与体系中悬浮物质含量及其大小形状等有关。Rayleigh散射理论表明溶液体系内颗粒直径的增加通常会导致体系浊度的增加[21]。由图4A可知，在不同pH值条件下，体系浊度差异显著（P＜0.05）。随着体系pH值的增大，浊度值呈先增大后减小的趋势，表明pH值能在一定程度上改变复合体系的颗粒大小和形状。浊度值在pH 4.5时最大，表明此时LMP/SC复合体系对光线通过的阻碍最大，这与Zeta电位及粒径的测定结果一致。由图4B可知，随着pH值的减小，LMP/SC复合体系颜色先略微变深，后逐渐变浅，由最初的乳白色共溶体系变为浅白色的半透明水凝胶状态。

2.4 pH值对复合体系微观结构的影响

图5 LMP/SC复合体系的扫描电子显微镜图Fig. 5 SEM photographs of LMP/SC composite system

由图5A、B可知，在pH 5.5时体系结构比较杂乱，松散的片状结构呈堆砌状态。但随着pH值的减小，体系内片状结构趋于规则；在pH 5.0时，复合体系中光滑的片状LMP贴附在SC表面，同时条状LMP向外延伸连结体系其他部分，说明pH值在高于SC等电点的酸性条件下，仍存在部分果胶吸附在酪蛋白胶束表面，形成微凝胶网络结构[29]。

由图5C、D可知，LMP/SC复合体系微观结构随pH值的降低发生明显变化，体系变得更为立体致密。pH值在SC等电点附近时，体系内LMP分子链伸展连结球状SC颗粒，形成连续性更佳的网络结构。表明LMP能改善SC在等电点附近失稳聚沉的现象，提高酸性条件下SC的稳定性。这与阴离子多糖黄原胶在酸乳中能通过静电作用和空间位阻作用改善酪蛋白簇的原有结构相类似[30]。

由图5E、F可知，当pH值降低到SC等电点以下后，LMP/SC复合体系结构进一步发生改变，阴离子多糖LMP开始填充在SC的空隙中，形成一种“嵌入”式结构。结构整体空隙数目减少，体系内的分支更细薄，且呈现出片状、条状结构的缠绕钩挂。此时体系开始表现出以LMP为主体的凝胶网络结构，当pH 3.0时，这种结构最为明显，光滑而纤细的链状LMP结构像触头一样伸展在体系中。

3 讨 论

3.1 pH值对复合体系流变学特性的影响

食品结构往往能被外力及形变作用改变，研究流变行为可对食品体系的分子形态及微观结构有进一步了解。实际上流变特性指体系同时表现出固体的弹性和液体的黏性[11]。LMP/SC复合体系流变学测定结果表明：LMP/SC复合体系在pH 3.0～5.5时，呈现出剪切变稀的非牛顿流体流动特性。由于LMP/SC复合体系内存在链状分子构成的胶体粒子，在低剪切速率时这些链状分子间相互钩挂缠绕，体系表现出黏度较大的状态；在剪切速率较大时链状粒子较为散乱，相互勾挂现象减少，体系出现剪切稀化现象。随着pH值的减小，体系先呈现出表观黏度逐渐增大、流动性逐渐变小的现象；而当pH值在SC等电点附近，体系表观黏度出现骤减；而随着pH值的进一步减小，复合体系表观黏度继续增大、流动性也进一步减小。在复合体系中，随着pH值的降低，LMP可吸附在SC表面，而SC和LMP结合程度也影响体系的黏度和流动性。因未吸附在SC表面的LMP能在一定程度上增加体系的黏度，同时这部分LMP能与LMP/SC复合胶粒之间形成弱网络结构。

3.2 pH值对复合体系结构特征的影响

Zeta电位和粒径可以反映LMP/SC复合体系结构的稳定性，测定结果表明：随着pH值减小，LMP/SC复合体系颗粒先增大后减小，稳定性先减小后增大。pH值主要是通过影响氨基、羧基等大分子功能集团的离子化程度影响多糖/蛋白质复合体系的相互作用[7]，随着pH值减小，带负电的多糖LMP能通过静电作用逐渐吸附在带正电的SC颗粒表面，使其粒径变大。在SC等电点附近形成的LMP/SC复合物带有一定数量的净负电荷，胶粒间的静电排斥作用较大，足以抵抗胶粒间的进一步复合凝聚，改善单一蛋白质分子在等电点附近失稳聚沉现象，此时Zeta电位值为负。当pH值低于SC等电点时，Zeta电位值变为正。SC所带正电荷增加，多糖LMP侧链上的羧基基团被质子化而带有部分净正电荷，净负电荷减少[9]。结构特性表明：当pH值高于SC等电点时，SC胶束表面的κ-酪蛋白存在的正电荷区域也能与阴离子多糖LMP发生一定程度的静电络合作用[29]。随着pH值减小，复合体系由溶胶结构向微凝胶网络结构发生转变。在SC等电点（pH 4.5）附近，带负电的LMP与带正电的球状SC分子通过强静电作用形成稳定的纳米复合物，同时链状LMP分子起到连结作用形成网状结构。随着pH值进一步减小，当pH 3.0～4.0时，体系开始更多呈现多糖LMP为主体的凝胶网络结构[10]，这可能是LMP分子链间的羧基，通过SC“架桥”实现连接；同时LMP分子间排斥作用非常小，链间距离降低，形成氢键；而SC的存在使得体系水分活度较低，此时复合体系能产生足够的疏水相互作用稳定分子的网状结构。故在低pH值体系中，氢键及疏水相互作用均有助于LMP凝胶结构的形成。

4 结 论

pH值对LMP/SC复合体系具有较大的影响。随着pH值减小，复合体系能从共溶阶段过渡到凝胶阶段。在pH值高于SC等电点时，已存在少量LMP吸附在酪蛋白胶束带正电的基团上，形成微凝胶结构的状态，随着pH值的降低，体系表观黏度增大，流动性减弱；当pH值减小到其等电点附近时，LMP/SC复合体系由静电相互作用形成较为稳定的网络结构；随着pH值继续减小，体系形成以LMP为主体的凝胶网络结构。研究结果不仅为LMP/SC复合体系在乳制品中的应用提供理论依据，还能拓宽其在食品行业中的应用范围。