再生纤维素凝胶对乳清分离蛋白预乳化液稳定性的影响

赵尹毓，田筱娜，周光宏，张万刚*

（南京农业大学食品科技学院，江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，肉品加工与质量控制教育部重点实验室，江苏 南京 210095）

食品乳化液是一种热力学不稳定体系[1-2]，容易出现失稳现象，乳化液失稳后会发生脂肪颗粒上浮、油水两相分离以及底部出现沉淀等现象，严重影响到产品的货架期和感官品质[3]。

有研究表明，蛋白质是一种大分子表面活性剂，能够在脂肪颗粒表面上吸附并定向排列形成界面吸附层，降低脂肪球界面张力，防止脂肪颗粒间的聚结，提高分散体系的稳定性[4]。但是蛋白质稳定的乳化液对pH值、温度和离子强度等环境条件十分敏感，尤其在蛋白质等电点附近、高温处理或较高离子强度下，乳状液易发生粒径增大、乳状液分层等脱稳现象，限制了其在食品加工过程中的应用[4-5]。

前期研究发现不同多糖、变性淀粉及改性纤维素可以提高乳化液的黏稠度，吸附于液滴表面增加界面膜的厚度，在乳化液中形成凝胶结构提供空间屏障，改变食品体系的物理特性，降低液滴的运动速率，提高乳化液的稳定性[6-8]。微晶纤维素（microcrystalline cellulose，MCC）是一种水不溶性纤维素，由于分子间氢键作用力强而导致其表面活性差，只能通过吸水溶胀稳定乳化液[9-10]。由MCC通过磷酸溶解和水再生得到的凝胶态再生纤维素（regenerated cellulose，RC）具有较高的表面活性，具有疏水和亲水基，因此具有很强的增稠能力[11]。将纤维素多糖与蛋白质组合，可以通过增加脂肪球周围的吸附层的厚度以及形成一定的空间位阻，改善乳液体系的稳定[3,12]。

乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）营养性良好，且具有乳化特性、起泡特性和凝胶特性，在食品加工中常被用作乳化剂或发泡剂等[13]。由WPI稳定的橄榄油乳化液粒径小，营养价值好，可被用作脂肪替代物生产低脂肉制品[14]。但由于WPI容易受到加工环境条件的影响，如pH值、温度、离子强度等，使橄榄油乳化液发生粒径增大，乳化液分层等脱稳现象。

本研究旨在向WPI-橄榄油预乳化液中添加不同比例RC凝胶，通过测定乳化液表观稳定性、分层指数、乳滴粒径大小、乳化液流变特性以及观察微观结构的变化情况，研究RC凝胶对WPI-橄榄油预乳化液稳定性的影响，为提高蛋白质乳化液稳定性提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

欧丽薇兰橄榄油 市购；MCC 山东曲阜天利药用辅料有限公司；牛乳WPI（含蛋白质90%） 河南正兴食品有限公司；85%磷酸（食品级） 江苏澄星磷化工有限公司。

1.2 仪器与设备

LSHZ-300型冷冻水浴恒温振器 常州诺基仪器有限公司；Beckman Avanti J-E离心机 美国Beckman Coulter公司；Ultra Turrax T-25 Basic高速匀浆机、C-MAG HS7磁力搅拌器 德国IKA公司；FE20 pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱上海森信实验仪器有限公司；Masterizer 3000激光粒度分析仪 英国马尔文仪器有限公司；MCR301旋转流变仪奥地利安东帕（中国）有限公司；奥林巴斯FV3000激光共聚焦显微镜 南京奥力科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RC的制备

参照Jia Xuejuan等[15]的方法并稍作修改。取4 g MCC，用12 g去离子水润湿、摇匀，加入160 mL 4 ℃预冷的85%食品级磷酸，获得乳白色悬浮液；置于4 ℃振荡器中以150 r/min转速孵育24 h，获得澄清、透明的纤维素胶体溶液；取出后加入800 mL去离子水混匀静置2 h，然后16 500×g离心15 min，重复水洗离心至上清液pH值恒定在6.0～6.5之间，获得半固体凝胶态的RC，采用烘箱称重法测定RC最终质量分数为4.50%。

1.3.2 RC乳化液的制备

将2 g WPI充分溶解在20 mL去离子水中，然后加入橄榄油，12 000 r/min高速匀浆1.5 min获得预乳化液；将RC和相应的去离子水加入预乳化液，继续12 000 r/min匀浆1.5 min，最终得到RC乳化液。乳化液中橄榄油质量分数为30%，WPI的质量分数为2.0%，RC添加量分别为0%、0.4%、0.8%、1.2%和1.6%。为了避免匀浆过程中产热使蛋白质变性，整个匀浆过程在冰浴中进行。

1.3.3 乳化液稳定性

将制备好的乳化液分别取12 mL于透明玻璃瓶中，室温条件下静置1 周，观察记录乳化液每天的分层情况，并拍照保存；乳化液分层指数是指乳化液在贮存期间下层（乳清层）的高度占乳化液总高度的比值，按公式（1）计算：

式中：Hs为实测下层清液高度/cm；Ht为乳化液的总高度/cm。

1.3.4 乳化活性

参考Diao Xiaoqin等[16]的方法并稍作修改。取50 μL乳化液，加入5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液混匀，在波长500 nm处测定样品吸光度，记为A0；在乳化液制备完成的30 min和60 min时重复之前操作，测定吸光度为A30和A60。乳化活性按公式（2）计算：

式中：A为乳化液分别在0、30 min和60 min时的吸光度；C为乳化液中WPI质量浓度/（g/mL）；φ为乳化液中橄榄油的体积分数/%；N为稀释倍数（100）。

1.3.5 粒度大小及分布

乳化液中油滴的粒度大小及分布通过Mastersizer 3000激光粒度分析仪测定，粒度大小以体积质量等效平均直径（D4,3）表示。测定参数为：湿法进样，颗粒折射率为1.476，吸收率为0.001；分散剂为水，折射率为1.330。测试前将乳化液分别用等体积的水和1.0% SDS稀释[17]，可以通过两者粒度大小的变化，按公式（3）计算乳化液滴的絮凝程度。

式中：D4,3-SDS为不加SDS时测定的乳化液滴直径/μm；D4,3+SDS为加SDS时测定的乳化液滴直径/μm。

1.3.6 流变特性

乳化液的流变特性通过MCR301旋转流变仪测定，测定时温度设定为25 ℃，转子型号选择PP50，间隙设置为0.5 mm。表观黏度在0.01～101 s-1剪切速率范围内测定，得到黏度随剪切速率变化的曲线；动态振荡扫描（储能模量G′、损耗模量G′）在应变为0.1%，频率为0.1～100 Hz范围内测定，得到G′、G”随频率变化的曲线。

1.3.7 微观结构

乳化液微观结构通过激光共聚焦显微镜观察，向5 mL乳化液中分别加入200 μL尼罗红（0.01%）和200 μL尼罗蓝（0.01%），充分混匀后置于摇床过夜染色。取微量染色乳化液，在488 nm（尼罗红）和633 nm（尼罗蓝）波长，置于60 倍目镜下观察乳滴的微观结构及分布情况。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 乳化液稳定性结果

2.1.1 表观稳定性

如图1所示，乳化液制备后的初期在表观上没有显著差异（图1A），放置过程中，未添加RC的乳化液最先开始出现分层现象。放置7 d后，由图1B可知，未添加RC的乳化液分层最为严重，在下层出现蛋白聚集物，且随着放置时间的延长，乳化液的分层界面越来越明显，乳化液体系是一种絮凝物与非絮凝物共存状态[18]。随着RC添加量的增加，分层现象得到了有效抑制，当添加0.8%及以上的RC时不再发生乳析分层，主要原因可能是RC凝胶的增稠能力增强，乳化液黏度增大。

图1 RC添加量对乳化液表观稳定性的影响Fig. 1 Effect of RC concentration on the visual appearance of emulsion

2.1.2 分层稳定性

图2 RC添加量对乳化液分层指数的影响Fig. 2 Effect of RC concentration on the creaming index of emulsion

由图2可知，添加0%和0.4% RC的乳化液均在第1天开始出现分层现象，分层指数分别为56.82%和27.27%，添加0.8%、1.2%和1.6% RC处理组的乳化液在存放时间内都没有发生分层。这是由于当连续相中含有0.4% RC时，不能产生足够高的黏度而形成弱凝胶，导致乳化液滴之间聚结，絮凝程度高，形成较大颗粒，所以分层较快。乳化液的分层稳定性随RC添加量的增加而增强，主要原因可能是随着RC添加量的增加，增加了连续相黏度，同时由于RC在乳化液中的空间位阻作用，使液滴粒度减小，液滴与连续相之间的密度差减小，分层稳定性提高。

2.2 乳化液粒度大小及分布

表1 RC添加量对乳化液粒度大小及絮凝程度的影响Table 1 Effect of RC concentration on the particle size and fl occulation degree of emulsion

图3 RC添加量对乳化液粒度分布的影响Fig. 3 Effect of RC concentration on the particle size distribution of emulsion

如表1所示，在不添加SDS的情况下，随着RC添加量的增加，乳化液液滴D4,3先减小后增大，添加1.2% RC时乳化液液滴大小显著小于其他RC添加量处理组（P＜0.05）。如图3所示，乳化液颗粒直径的分布随着RC添加量的增大整体趋势向左偏移，且当RC添加量增加到1.2%时第3个峰消失，第2个峰高增加，即大粒径的液滴减少，小粒径液滴增加，表明粒度大小更加均匀。

在测定粒径大小的过程中加入SDS是为了使WPI发生变性，导致吸附在乳滴表面的蛋白减少，引起乳化液发生絮凝现象[19]，利于研究RC对乳化液絮凝变化的影响。添加SDS与不添加SDS所测得的乳化液D4,3趋势相同，但添加SDS的乳化液颗粒略小于不加SDS处理组，这是由于SDS使蛋白变性，吸附在表面的蛋白减少。不添加RC或添加量较低（0.4%）时乳化液的絮凝程度高，随着RC添加量增加到1.2%时，乳化液絮凝程度显著降低（P＜0.05），当RC添加量达到1.6%时，絮凝程度增加，说明RC只有在适当添加量条件下才可以抑制乳化液发生絮凝现象。

虽然RC是水不溶性多糖，但是可以通过氢键、疏水力与蛋白质相互作用，使其在乳化液体系中具有良好的分散性[20-21]。连续相中随着RC添加量增加，乳化液黏度增大，为乳化液滴提供了良好的空间屏障，减缓了乳化液滴移动的速率，使乳化液之间聚结，絮凝程度降低，粒径随之减小[22]。但是当凝胶态RC添加量达到1.6%时，D4,3略有增加，可能是因为在连续相中RC添加量过多，导致液滴与液滴间隙过小，阻碍了均质过程中WPI在连续相中的移动以及在油滴表面的吸附作用[23]，或者把已经吸附在乳滴表面的蛋白排挤出来，进而使乳化液出现耗损絮凝，聚结在一起形成较大的颗粒[4]。Liu Liya等[24]研究结果与本实验相似，乳化液中过量的羧甲基纤维素诱导乳化液发生耗损絮凝。分层现象与粒度大小、絮凝情况密切相关，当RC添加量达到1.6%时，虽然颗粒增大，絮凝程度升高，但由于其黏度过大，阻止了分层现象的发生（图1）。

2.3 乳化液微观结构

如图4可知，没有添加RC或添加量较低（0.4%）的乳化液油滴较大；RC添加量为0.8%时乳化液滴显著减小，但油滴大小均一性不好；添加1.2% RC稳定的乳化液粒径最小，且分布均匀，分散性好；RC添加量为1.6%时，油滴略有增大，并且出现乳滴聚集成团现象。乳化液微观结构图与乳化液粒度大小（表1）的结果相一致。随着RC添加量的增加，连续相中RC结构的增强，乳化液中RC添加量为1.2%时，表现出很强的增稠能力，同时RC可能在乳化液中形成网状结构[15]，从而削弱了液滴与液滴间的聚集作用，使乳化液滴可以均匀地分散在连续相中，且保持较小的粒径。有研究表明，山竹微纤化纤维素由于其较大的纵横比，形成较强的相互作用和无序的网络结构，阻碍了乳化液发生絮凝从而达到稳定乳化液的目的[25]。本研究中的RC具有与山竹微纤化纤维素类似的形态和凝胶特性。

图4 RC添加量对乳化液微观结构的影响Fig. 4 Effect of RC concentration on the CLSM micrograph of emulsion

2.4 乳化活性

表2 RC添加量对乳化液乳化活性的影响Table 2 Effect of RC concentration on the EAI of emulsion

如表2所示，在0 min条件下，从整体上看，乳化活性随着RC添加量的增加呈增加趋势，但是当添加量增加到0.8%及以上时差异不显著，在30 min和60 min后，乳化液中添加了RC的乳化活性显著高于没有添加RC处理组（P＜0.05），尤其在60 min条件下，没有添加RC的乳化活性仅为1.46 m2/g，而添加1.2% RC的乳化活性提高到4.55 m2/g。这证明RC在WPI乳化液中起到了良好的乳化作用，可以被认为是乳化稳定剂。这与乳化液粒度大小与分层稳定性的结果具有一致性，乳化活性越高，乳化液滴越小，导致乳化液稳定性越好。

2.5 乳化液流变特性

2.5.1 表观黏度

图5 RC添加量对乳化液表观黏度的影响Fig. 5 Effect of RC concentration on the apparent viscosity of emulsion

如图5所示，乳化液的表观黏度随剪切速率增加而降低，呈现出剪切稀化行为，属于非牛顿假塑性流体[26]。乳化液黏度的变化主要是由于乳化液滴聚集状态的变化，在剪切过程中乳化液液滴的絮凝结构遭到破坏[27]。没有添加RC的乳化液表观黏度最低，随着RC添加量的增加，乳化液黏度逐渐增大。这是因为随着RC添加量的增加，结合水的能力增强，增稠能力提高，体系的零剪切黏度增加，随着剪切速率的增加，乳化液的内部结构被破坏，分子按照剪切速率的方向线性排列，样品的黏度和剪切应力逐渐减小[28]。这与Hu Hongyan等[10]的研究结果具有一致性，可能是因为RC形成特定的空间网络结构，而增大乳化液的黏度，高黏度可以抑制液滴的移动，防止其聚结和分层现象的发生，从而获得更好的乳液稳定性。这些结果与乳化液的粒度大小和分层稳定性的结果相一致。

2.5.2 动态振荡扫描特性

图6 RC添加量对乳化液频率扫描的影响Fig. 6 Effect of RC concentration on the frequency sweep of emulsion

动态振荡实验是研究乳化液黏弹性的重要方法，可以通过模量的大小显示乳化液体系结构的强弱[29]。在应变保持1.0%不变，乳化液处于线性黏弹区，进行乳化液的G′和G”的测定，结果如图6所示。不同乳化液的G′和G”随着振荡频率的增加稍有增加趋势，但随着RC添加量的增加，G′和G”对频率变化的依赖性降低，变化幅度减小，变化曲线趋于平稳，并且在线性黏弹性范围内G′大于G”，表明乳化液属于一种典型的弹性凝胶体系[1,30]，而且说明液滴间相互作用增强，乳化液内形成了稳定结构[7,31]，这种稳定的结构可能归因于RC在流动相中形成凝胶状网络结构。

3 结 论

本实验研究不同添加量的RC对WPI-橄榄油预乳化液稳定性的影响，MCC通过磷酸溶解、水再生得到的RC结晶区部分被破坏[15]，RC可以通过氢键和疏水作用在乳化液体系中有良好的分散性，而且凝胶态的RC相比与粉末状的MCC具有更强的增稠能力[32]。随着RC添加量的增加，乳化液的黏度增强，结构更加稳定。其中RC添加量为1.2%时，乳化液的粒径最小，絮凝程度最低，稳定性最好。RC能够稳定WPI乳化液的原因可能是RC凝胶的增稠作用，以及在乳化液中形成网络结构，延缓液滴的移动，形成空间屏障防止液滴间的絮凝与聚结，从而起到稳定WPI-乳化液的作用。在30%橄榄油和2.0%的WPI预乳化液中，添加1.2% RC可以有效改善蛋白质预乳化液的乳化稳定性。