酒石酸沃尼妙林的制备和评价

朱馨乐，徐士新，赵琪，黄耀凌，李建,赵晖，李丹，孙雷

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

沃尼妙林(Valnemulin)是20世纪90年代中期正式上市的一种动物专用抗生素，属第二代截短侧耳素类(Pleuromutilin)半合成抗生素[1-3]。具有毒性低、抗菌活性强、抗菌谱广、代谢快、不易产生耐药菌株、不易导致体内药物蓄积残留等优点，主要用于猪、牛、羊及家禽的支原体病和革兰氏阳性菌感染疾病的防治[4-8]。1999年欧共体批准沃尼妙林用于预防与治疗猪痢疾钩端螺旋体感染引起的和由肺炎支原体感染引起的猪地方性肺炎，2004年，批准预防由结肠菌毛样短螺旋体感染引起的猪结肠螺旋体病和治疗由细胞内劳森菌感染引起的猪增生性肠病。沃尼妙林以盐酸沃尼妙林盐形式应用在兽医临床领域，但盐酸沃尼妙林极易水解，对温度和光照敏感，储存稳定性较差，需采用流化床工艺制备成颗粒剂使用，在制粒过程中会有1/3～1/2的有效成分损失[9-10]。在动物口服给药时，由于适口性差、刺激性强而影响采食，不利于达到预期的治疗效果[11-12]。因此，急需开发新的适用于兽医临床的应用形式。

本研究提出了一种沃尼妙林酒石酸盐的制备方法，理化性质研究表明酒石酸沃尼妙林有良好的晶形，性质稳定，易于储存；生产制剂时，不需专用的高温高压设备，通过与饲料简单混合即可制成预混剂，而且在制备过程中能避免有效成分的损失；在口服时，晶态盐由于改良了适口性而更容易被动物接受，扩展了沃尼妙林在兽医临床上的应用范围(图1)。

图1 酒石酸沃尼妙林分子结构式Fig 1 Structure of valnemulin hydrogen tartrate

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 D8 ADVANCE XD-3 X-射线粉末衍射仪(德国Bruke公司)；Phillips XL30 SEM-FEG扫描电子显微镜(荷兰Eindhoven公司)； Waters 2695高效液相色谱仪，配UV检测器(美国Waters公司)；AG-285电子天平(瑞士 Metteler公司)。

1.2 试剂与药品 沃尼妙林为康倍德化学品有限公司制备(含量95.92%)；盐酸沃尼妙林来源为龙翔公司(含量96.30%，生产日期：201005)；N, N-二甲基乙酰胺、酒石酸均为分析纯；乙腈、甲醇为色谱纯，德国默克公司；水为超纯水；酒石酸沃尼妙林标准品来源为Dr.Ehrenstorfer GmbH公司(含量98.70%，批号：Y0000533)。

1.3 酒石酸沃尼妙林的制备 在室温的条件下，将8 g沃尼妙林溶于50 mL乙腈与N, N-二甲基乙酰胺(60∶40，V/V)组成的混合溶剂中，然后将1.6 g酒石酸加到沃尼妙林溶液中，在温度60 ℃的条件下反应2.0 h，直至该反应液澄清，让反应液冷却至室温，结晶，过滤，真空过夜干燥，得到酒石酸沃尼妙林晶体。

1.4 理化性质分析 扫描电镜(SEM)分析：使用荷兰Eindhoven公司Phillips XL30 SEM-FEG扫描电镜观察酒石酸沃尼妙林与盐酸沃尼妙林固体粉末，操作电压15 kV。X-射线衍射分析：使用由布鲁克公司的Bruker-D8 ADVANCE XD-3 X-射线衍射仪测定盐酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林的X- 射线衍射谱。在40 kV/30mA、CuK-α1X 射线(波长=1.5406 埃)条件，在2θ为5°～ 40°的范围，使用0.2 秒钟计数/0.018°步长以连续模式运行的测角计测定。

1.5 盐酸沃尼妙林与酒石酸沃尼妙林的稳定性试验

1.5.1 光照射试验 取真空干燥至恒重的样品适量，参照(2006-2011)《兽药研究技术指导原则汇编》中兽用化学药物稳定性研究技术指导原则，将含量为99.7%酒石酸沃尼妙林和99.0%盐酸沃尼妙林平铺于表面皿中，在照度为4500±500 LUX的条件放置，于0(对照)、5、10、25、60 d取样，用高效液相色谱(HPLC)仪测试。

1.5.2 引湿性试验 取适量样品平铺于称量瓶中，在温度30 ℃，湿度65%和78%的条件下分别放置24、48 h，取样测试水分吸收量。

1.5.3 高效液相色谱(HPLC)分析 沃尼妙林的含量测定和杂质测定方法参考欧洲药典《盐酸沃尼妙林的测定》，配置UV检测器的Waters 2695系统，十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂的Waters X-Bridge 柱(4.6 mm×150 mm，3 μm particle size)进行分离测定。

1.6 体外抑菌试验菌株 参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法测定酒石酸沃尼妙林与盐酸沃尼妙林的抑菌效果，比较所选试验菌株的最小抑菌浓度(MIC)。质控菌株：肺炎链球菌ATCC 49619和其他分离菌株：胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌，猪链球菌、溶血巴氏菌、金黄色葡萄球菌，来源于中国兽医药品监察所菌种保藏中心。

2 结果与分析

2.1 扫描电镜(SEM)分析 酒石酸沃尼妙林与盐酸沃尼妙林的扫描电镜结果列于图2。可以看出两种盐有不同的形貌，酒石酸沃尼妙林呈现杆状结晶形状，而盐酸沃尼妙林呈现出大块、易碎的片状固体结构。

2.2 X-射线衍射分析 酒石酸沃尼妙林与盐酸沃尼妙林的X-衍射谱分析结果列于图3。从图3可以看出酒石酸沃尼妙林在5.563,6.361,8.741,10.560,11.223,11.891,12.775,13.486,15.048,16.384,17.689和17.689(2θ ± 0.2°)处呈现出特征峰，然而盐酸沃尼妙林的X-衍射谱无特征峰出现，只有一个坡度变化宽展而缓和的吸收峰。

图2 盐酸沃尼妙林 (A)和酒石酸沃尼妙林(B)的扫描电镜图像Fig 2 Scanning electron micrographs (SEM) of valnemulin hydrochloride (A) and (B) valnemulin hydrogen tartrate crystal

图3 盐酸沃尼妙林(A)和酒石酸沃尼妙林(B)的粉末X-衍射光谱Fig 3 X-ray powder diffractometry (XRD) spectra of valnemulin hydrochloride (A) and valnemulin hydrogen tartrate crystal (B)

2.3 稳定性试验 为了比较盐酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林理化性质的稳定性，进行了光照和引湿性试验。图4为盐酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林在0(对照)、5、10、25、60 d含量的变化，可以看出，光照60 d以后，酒石酸沃尼妙林的含量为96.2%，与99.7%的初始含量相比，降解了3.5%，然而盐酸沃尼妙林含量的降低较明显，由99.0%降至80.8%，即减少了18.2%。

图4 光照条件下酒石酸沃尼妙林和盐酸沃尼妙林中游离态沃尼妙林随时间变化曲线Fig 4 Time courses of the free valnemulin levels of valnemulin hydrogen fumarate and valnemulin hydrochloride under irradiation condition.

图5列出了盐酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林在相对湿度(RH)为65%和78%的条件下吸水量的变化。结果表明盐酸沃尼妙林，在湿度65%的条件下吸水量为4.50%，而在湿度78%的条件下吸水量高达9.71%，酒石酸沃尼妙林在上述条件下的吸水量分别为1.30%、1.40%。

2.4 体外抑菌试验 为确定酒石酸沃尼妙林抑菌效果，进行了体外抑菌试验，并与盐酸沃尼妙林的MIC值进行了比较。如表1所示：酒石酸沃尼妙林与盐酸沃尼妙林对细菌的敏感浓度一致：对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度均为4 μg/mL，对副猪嗜血杆菌的最小抑菌浓度均为1～4 μg/mL，对多杀巴氏菌的最小抑菌浓度均为16～32 μg/mL，对猪链球菌的最小抑菌浓度均为1 μg/mL，对溶血巴氏菌的最小抑菌浓度均为4 μg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为0.02 μg/mL，对质控菌株肺炎链球菌的最小抑菌浓度均为16 μg/mL。

图5 在30 ℃, 65%和78%湿度条件下酒石酸沃尼妙林和盐酸沃尼妙林吸水量随时间变化曲线Fig 5 Profiles of adsorption of water of valnemulin hydrogen tartrate and valnemulin hydrochloride samples at 30 ℃, in 60% and 78% RH.

3 讨论与结论

3.1 外部形貌和内部结构形态分析 药物成盐是改善药物分子理化性质、提高其成药性的有效手段之一。在新药研发早期阶段，将候选化合物成盐可改善候选化合物的理化性质，如溶解度、结晶度、吸湿性、熔点和固态稳定性，减少其不良反应等[13-15]。药物盐型的筛选对选择具有适宜药学性质的固态剂型有重要的指导作用。

由于药物与不同的盐类反应条件的差异：比如溶剂、温度、压力、晶种，会产生不同的晶体/无定型态，从而产生不同的物理化学特性和药学效果[15]。本研究扫描电镜(SEM)分析结果体现出盐酸沃尼妙林和结晶型酒石酸沃尼妙林形貌上的显著差异；X-射线衍射分析表明盐酸沃尼妙林和结晶型酒石酸沃尼妙林有不同的XRD特征，盐酸沃尼妙林包含了一个宽展形状、无特征吸收的峰，说明盐酸沃尼妙林是无定形态，而酒石酸沃尼妙林的X-射线衍射图中可以看到一组尖锐的强峰，且表现出较高的结晶度。沃尼妙林2种不同盐类的XRD的分析结果与药物稳定性分析一致，表明酒石酸沃尼妙林优良的稳定性归因于其晶体特性。

表1 酒石酸沃尼妙林和盐酸沃尼妙林的体外抗菌活性(MIC, μg/mL)Tab 1 Antibacterial activity (MIC, μg/mL) of valnemulin hydrogen tartrate and valnemulin hydrochloride in vitro.

a最低抑菌浓度(MIC):抑制细菌生长繁殖的最低药物浓度;bApp胸膜肺炎放线杆菌；c HPS副猪嗜血杆菌；d PM 多杀巴氏菌

3.2 稳定性试验

3.2.1 光照对不同沃尼妙林盐稳定性的影响 光试验表明，经60 d的照射，盐酸沃尼妙林含量降低比较明显，由99.0%将降至80.8%，即减少了18.2%，酒石酸沃尼妙林的含量为96.2% ，略低于99.7%，相对于盐酸沃尼妙林，酒石酸沃尼妙林大大降低了对光照的敏感性。为了从光降解的机理方面解释酒石酸沃尼妙林和盐酸沃尼妙林光照稳定性的差异，本研究采用图6的液相色谱图比较了盐酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林光照射试验降解产物的差异。图6 (A1)显示照射60 d后盐酸沃尼妙林产生了一些小的降解产物峰，通过与标准品的保留时间匹配，确定主要降解产物沃尼妙林亚砜，保留时间为6.2 min。与先前报道的富马酸沃尼妙林的光降解产物——沃尼妙林亚砜研究结果相一致[16]。相反，如图6(B1)所示，在整个60 d的光照试验中，酒石酸沃尼妙林几乎没有检测到明显的降解产物。上述结果表明酒石酸沃尼妙林晶体，稳定性优于无定型的盐酸沃尼妙林。

3.2.2 湿度对不同沃尼妙林盐稳定性的影响 引湿性是影响化合物稳定性的主要因素之一。酒石酸沃尼妙林和盐酸沃尼妙林在不同相对湿度(RH)的条件下引湿性结果表明酒石酸沃尼妙林的吸水量增加较小，在相对湿度65%和78%的条件下的吸水量分别为1.40%、1.30%，根据2010版《中国兽药典》，判定为具有轻微引湿性(<2%)；盐酸沃尼妙林在湿度78%的条件下吸水高达9.71%，在湿度65%的条件下吸水也有4.50%，超出中国兽药典规定的轻微引湿性(<2%)的限量，判定为具有引湿性。引湿性试验结果表明，酒石酸沃尼妙林对湿度变化不敏感，表现出优越的抗吸水性，而盐酸沃尼妙林有极强的吸湿性。酒石酸沃尼妙林的贮存条件不苛刻，应用范围更广泛，在开发简单和新颖的剂型方面具有潜在的应用价值。

3.3 MIC试验 酒石酸沃尼妙林对革兰阴性和革兰阳性病原菌的体外抗菌活性试验MIC 值与无定形盐酸沃尼妙林一致，二者有相同的抑菌活性，可以推断水溶液中，酒石酸沃尼妙林和盐酸沃尼妙林均可迅速解离，游离态的沃尼妙林碱发挥药效。酒石酸沃尼妙林与盐酸沃尼妙林药效的体外抑菌试验等效性，以及酒石酸沃尼妙林对光照、湿度的稳定性和动物饲喂适口性表明晶态的酒石酸沃尼妙林，具备潜在的应用价值。

图6 盐酸沃尼妙林(A)和酒石酸沃尼妙林(B)光照前(0 day)后(90 day)的高效液相色谱图Fig 6 HPLC spectra of valnemulin hydrochloride (A) and valnemulin hydrogen tartrate(B) after irradiation for 0 and 90 days.

本研究制备了一种结晶态的沃尼妙林有机酸盐——酒石酸沃尼妙林，用XRD和SEM对其物理化学性质进行表征。XRD和SEM结果表明酒石酸沃尼妙林的形貌和内部结构完全不同于盐酸沃尼妙林，前者具有高的结晶性,而后者是无定型模式。在光照条件下，酒石酸沃尼妙林具有比盐酸沃尼妙林更强的稳定性。盐酸沃尼妙林的光降解产物主要是沃尼妙林氧化亚砜。在65%和78% RH条件下盐酸沃尼妙林样品有吸湿性，而酒石酸沃尼妙林对湿度变化不敏感。抑菌敏感性测试试验表明酒石酸沃尼妙林和盐酸沃尼妙林盐有相同的抑菌活性。因此,酒石酸沃尼妙林贮存稳定、易于制备制剂、给药方便、减少人力物力、节约了养殖成本，具有应用潜力。