HPLC 法测定药用辅料L（+）- 酒石酸中的D（-）-酒石酸含量

贾玉荣， 尤昆

（江苏正大清江制药有限公司，江苏南京 210046）

1 引言

酒石酸有两个相同的手性碳原子，有三种立体异物体（左旋体（L-酒石酸）、右旋体（D-酒石酸）、 内消旋体）。 左旋酒石酸与右旋酒石酸为对映异构体。 天然存在的酒石酸都是右旋体。 右旋型酒石酸以游离的钾盐、钙盐、镁盐的形态广泛分布于高等植物中，特别是多存在于果实和叶中。 在制造葡萄酒时，会沉积大量酒石（氢钾盐）。 另外，在霉菌和地衣类中也常见到它的存在。 等量左旋体和右旋体的混合物，其旋光性相互抵消，组成外消旋体。 外消旋型酒石酸又称为葡萄酸。 葡萄汁或其他浆果汁在发酵制酒过程中，析出不溶于乙醇和水的右旋酒石酸的酸式钾盐沉积于酒桶壁上，称为酒石，酒石酸的名称就是由此而来。 左旋酒石酸可由外消旋体拆分获得，也存在于马里的羊蹄甲的果实和树叶中。

L(+)-酒石酸广泛用作饮料和其他食品的酸味剂，用于葡萄酒、软饮料、糖果、面包、某些胶状甜食。 利用其光学活性，作为化学拆分剂，用于制造抗结核病药物中间体DL-氨基丁醇的拆分；还可以作为手性原料用于酒石酸衍生物的合成；利用其酸性， 作为涤纶织物树脂整理的催化剂，谷维素生产的pH 调节剂。

L（+）-酒石酸同时为药用辅料，是DL-酒石酸拆分获得的。 其为注射剂中常用的pH 调节剂。中国药典2020 版[1]收录了L（+）-酒石酸的质量标准，目前文献报道的酒石酸含量测定方法有毛细管电泳法[2]、单柱阴离子色谱法[3]、电位滴定法[4]、高效液相色谱法[5,6]、原子吸收光谱法法[7]、分光光度法[8,9]，其中高效液相色谱法具有简便快速、灵敏度高的优点，为目前测定有机酸类化合物最有效的手段[10,11]。但均未见文献对其异构体D（-）-酒石酸的含量测定进行报道。 本文采用HPLC 法测定L（+）-酒石酸中的D（-）-酒石酸，为提高该药用辅料的质量标准提供参考。

2 材料与方法

2.1 仪器、试剂与材料

高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher 公司，UltiMate 3000），XS205DU 型电子分析天平（感量为0.01mg， 瑞 士METTER TOLEDO 公 司），KH7200B 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；乙醇（色谱纯，默克公司）；正己烷（色谱纯，默克公司）；三氟乙酸（色谱纯，阿拉丁）；纯化水（杭州娃哈哈有限公司）；标准品D（-）-酒石酸（厂家：阿拉丁，含量99.5%）；标准品L（+）-酒石酸（厂家：阿拉丁，含量99.1%）；药用辅料L（+）-酒石酸（贵州欣紫鸿药用辅料有限公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 标准品储备溶液的制备

分别精密称取D（-）-酒石酸对照品10.27mg、L（+）-酒石酸对照品10.33mg，置不同100mL 量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，分别作为D（-）-酒石酸和L（+）-酒石酸标准品储备液。

2.2.2 标准曲线溶液的制备

精密吸取D（-）-酒石酸和L（+）-酒石酸标准品各0.4mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL， 分别置10mL 量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 样品前处理

精密称取本品25mg，置25mL 量瓶中，加适量乙醇，超声处理（功率300W，频率50kHz）5min，放冷，加乙醇至刻度，摇匀，用0.45μm 微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4 液相色谱条件

色 谱 柱：CHIRALPAK IC （250mm ×4.6mm，5μm）； 柱温：25℃； 流速0.5 mL·min-1； 进样量：10μL；检测波长：210nm；以乙醇-正己烷-三氟乙酸（200∶800∶1）为流动相进行等度洗脱，运行时间为30min。 典型色谱图见图1。

图1 A-空白溶剂；B-混合标准品溶液

3 结果与分析

3.1 线性关系

取配制好的标准曲线溶液， 分别进样10μL，按 “2.2.4” 色谱条件下测定峰面积。 以峰面积Y 为纵坐标，以标准曲线溶液浓度X 为横坐标进行线性回归，各组分的回归方程及相关系数见表1。 可见该方法再实验范围内线性关系良好。

表1 各组分线性关系测定结果

3.2 检测限、定量限

以信噪比为3 计算检出限，信噪比为10 计算定量限，测得D（-）-酒石酸、L（+）-酒石酸的检测限 分 别 为27.626ng、26.694ng， 定 量 限 分 别 为41.094ng、41.302ng。 该方法灵敏度高。

3.3 精密度

取标准曲线溶液（浓度水平3）， 连续进样6次，结果测得D（-）-酒石酸、L（+）-酒石酸峰面积的RSD 分别为0.35%和0.28%，精密度结果见表2。

表2 精密度测定结果

3.4 重复性试验

取样品，平行试验6 份，结果D（-）-酒石酸的检出量为0.02%，RSD 为0.87%。 表明本方法重现性良好，结果见表3。

表3 重复性测定结果

3.5 中间精密度试验

取样品，由不同人员、在不同时间、采用不同仪器，平行试验6 份，结果D（-）-酒石酸的检出量为0.02%，与重复性6 份样品测定结果基本一致，12 份样品D（-）-酒石酸含量的RSD 为1.03%，方法的中间精密度良好，结果见表4。

表4 重复性测定结果

3.6 干扰试验

取空白溶剂-乙醇，按 “2.2.4” 色谱条件进样，空白溶剂在D（-）-酒石酸和L（+）-酒石酸相同保留时间附近无杂质峰干扰。

3.7 方法回收率

取9 份同批号样品约10mg（批号：Y20081001），精密称定，置10mL 量瓶中，每3 份分别精密加入L（+）- 酒石酸标准品储备溶液0.50mL、1.00mL、1.50mL，依法测定，结果D（-）-酒石酸回收率范围为99.6%～100.4%，RSD 为0.27%，回收率结果见表5。

表5 回收率测定结果

3.8 溶液稳定性

取供试品溶液， 分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h 进样，依法测定，结果表明该供试品溶液室温放置24h 内，D（-）-酒石酸含量基本一致，峰面积的RSD 为1.47%，且无新杂质生成，说明供试品溶液在24h 内稳定。 结果见表6。

表6 溶液稳定性结果结果

3.9 耐用性

适当改变流速（0.5±0.1mL/min）、柱温（25±2℃）、流动相比例（205∶795，195∶805），考察系统适用性溶液中D(-)-酒石酸与L(+)-酒石酸之间的分离情况。L(+)-酒石酸与其异构体峰的分离度均大于1.5，符合要求，表明该分析方法的耐用性良好。 结果见表7。

表7 耐用性试验结果

3.10 样品测定

取3 批样品，每批样品平行测定2 份，结果D（-）-酒石酸含量分别为0.015%、0.021%、0.027%。

4 讨论

4.1 流动相的选择

D（-）-酒石酸和L（+）-酒石酸为构型异构体，需采用手性柱进行分离。 选用正相体系通用的流动相正己烷-乙醇进行流动相筛选， 通过添加不同种类的酸性调节剂改善峰型， 主要考察了甲酸、乙酸及三氟乙酸。 结果以正己烷-乙醇-三氟乙酸为流动相时，峰形好，分离度大于5.0，且空白溶剂及其他杂质无干扰。

4.2 波长的选择

对D（-）-酒石酸进行了紫外全波长扫描，结果显示该成分无最大吸收波长， 仅有末端吸收，因此选择210nm 作为检测波长。 在该检测波长下，D（-）-酒石酸的检测限较低，灵敏度好。

4.3 流速的选择

采用手性柱进行分离， 对流速进行了筛选。结果表明当流速为0.5mL·min-1时，D（-）-酒石酸和L（+）-酒石酸的分离度合适，柱压较低。流速越低，消耗的流动相越少，柱压也越低，可以节约试验成本，同时减少对仪器的损耗。

4.4 柱温的选择

柱温过低会导致出峰时间延长，柱压力增大；柱温过高会导致柱流失。 常规采用25℃或者30℃进行液相色谱分析。 考虑到实验室的环境控制一般都在25℃左右，因此选择25℃作为柱温。 结果表明该柱温条件下，出峰时间及分离度均较适宜。