苯甲磺酰截短侧耳素国家对照品的研制

2019-04-09韩宁宁戴青赵晖杨秀玉

中国兽药杂志 2019年3期

韩宁宁，戴青，赵晖，杨秀玉

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

延胡索酸泰妙菌素是截短侧耳素类半合成的动物专用抗生素。苯甲磺酰截短侧耳素是合成延胡索酸泰妙菌素的中间体。《中国兽药典》2015年版一部收载了延胡索酸泰妙菌素及其可溶性粉与预混剂[1]。在原料及制剂的含量测定过程中，均需将延胡索酸泰妙菌素对照品与苯甲磺酰截短侧耳素对照品混合配制为系统适用性对照品溶液以测定系统适用性。

经查询，目前仅USP有该对照品供应，但价格昂贵，购买周期长。国家兽药基础信息查询系统[2]显示，目前泰妙菌素及其制剂的有效期内批准文号共600个，其中原料文号10个，预混剂文号293个，可溶性粉文号297个。如此众多的企业在泰妙菌素含量测定过程中均需使用苯甲磺酰截短侧耳素对照品进行系统适用性检查。然而，调研发现，在企业内部质量控制过程中，多使用自行生产的苯甲磺酰截短侧耳素原料充当系统适用性工作对照品，该原料无相应质量标准对其纯度进行控制。因此，研制苯甲磺酰截短侧耳素国家对照品对于延胡索酸泰妙菌素原料及制剂的生产及质量控制具有重要意义。

1 仪器与试剂

1.1 仪器与设备四级杆质谱仪(Waters XEVO TQD)；高效液相色谱仪(HPLC)(Waters e2695色谱系统，Empower 3色谱工作站)；二极管阵列检测器(PDA)(Waters 2998)；XS205分析天平(Mettler Toledo)。

1.2 药品与试剂溯源对照品来源/批号：USP/F0C328；苯甲磺酰截短侧耳素原料药来源：山东胜利生物工程有限公司。甲醇和乙腈(MERCK公司色谱纯试剂)。其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 分子量测定分别取苯甲磺酰截短侧耳素原料与对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并配制为10 μg/mL的溶液直接进样。离子源为ESI源，正离子全扫描模式(ESI+)。毛细管电压3.0 kv，锥孔电压30 kv，脱溶剂温度350 ℃。扫描范围m/z100～1000 Da，采集速率1.5 spectra/s。

2.2 鉴别

2.2.1 液相鉴别照纯度检查项下的色谱条件，取该检查项下的供试品溶液与对照品溶液进样，采集色谱图，考察供试品溶液主峰与对照品溶液主峰出峰时间是否一致，紫外光谱图是否一致。

2.2.2 红外鉴别参考《中国兽药典》2015年版一部延胡索酸泰妙菌素质量标准[1]中红外鉴别方法，取苯甲磺酰截短侧耳素原料与对照品适量，采用溴化钾压片法制片，采集4000～400 cm-1波段红外光谱图，考察二者是否一致。

2.3 纯度测定采用《中国兽药典》2015年版一部延胡索酸泰妙菌素质量标准[1]中含量测定项下的色谱条件测定纯度，考察其纯度是否符合《兽药标准品、对照品、对照药材质量标准》[3]中关于定位用对照品纯度不得低于90.0%的规定。十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；二极管阵列检测器，检测波长为212 nm，同时在200～400 nm波长范围内记录光谱图。以甲醇-碳酸铵溶液[取碳酸铵10 g，加水800 mL使溶解，加6%高氯酸溶液(取高氯酸8.5 mL，加水至100 mL，摇匀)24 mL，用水稀释至1000 mL，摇匀，滤过]-乙腈(49∶28∶23)为流动相；流速为1.2 mL/min。分别取延胡索酸泰妙菌素对照品和苯甲磺酰截短侧耳素对照品适量，用流动相溶解并稀释制成每1 mL各约含0.08 mg的混合溶液，作为系统适用性溶液，取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，泰妙菌素峰与苯甲磺酰截短侧耳素峰的分离度应大于2.0，理论板数按泰妙菌素峰计算不低于10000。取苯甲磺酰截短侧耳素原料适量，用流动相溶解并稀释制成每1 mL约含0.08 mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍。按面积归一化法计算苯甲磺酰截短侧耳素的纯度。

3 结果与分析

3.1 分子量苯甲磺酰截短侧耳素原料分子离子峰[M+Na]+为555.19 Da，参见图1。USP溯源对照品分子离子峰[M+Na]+为555.18 Da，参见图2。二者分子量一致。

3.2 鉴别

3.2.1 液相鉴别在纯度检查项下，212 nm波长下的色谱图中，苯甲磺酰截短侧耳素原料色谱图中主峰与对照品溶液主峰保留时间一致，且为单一物质峰(纯度角度小于纯度阈值)；在200 ～400 nm的波长范围内，两者紫外光谱图匹配(匹配角度小于匹配阈值)，最大吸收波长一致，可判定二者为相同物质(图3～图4)。

图1 苯甲磺酰截短侧耳素原料质谱图Fig 1 The MS spectrum of Tosyl Pleuromutilin material

图2 苯甲磺酰截短侧耳素USP对照品质谱图Fig 2 The MS spectrum of Tosyl Pleuromutilin USP reference

图3 苯甲磺酰截短侧耳素USP对照品光谱指数图Fig 3 The HPLC spectrum of Tosyl Pleuromutilin USP reference

图4 苯甲磺酰截短侧耳素原料光谱指数图Fig 4 The HPLC spectrum of Tosyl Pleuromutilin material

3.2.2 红外鉴别苯甲磺酰截短侧耳素原料红外光吸收图谱与对照品一致(图5～图6)。

图5 苯甲磺酰截短侧耳素USP对照品红外光谱图Fig 5 The IR spectrum of Tosyl Pleuromutilin USP reference

图6 苯甲磺酰截短侧耳素原料红外光谱图Fig 6 The IR spectrum of Tosyl Pleuromutilin material

3.3 纯度测定溶剂空白、系统适用性及苯甲磺酰截短侧耳素原料色谱图参见图7～图9。2个检验员各进样一份，每份重复进样2次。纯度结果见表1。平均纯度为99.7%，符合不低于90.0%的规定。

图7 溶剂空白色谱图Fig 7 The spectrum of solvent

图8 系统适用性色谱图Fig 8 The spectrum of system applicability

图9 苯甲磺酰截短侧耳素原料色谱图Fig 9 The spectrum of Tosyl Pleuromutilin material

纯度1/%纯度2/%检验员199.7199.76检验员299.6399.68平均99.7

4 讨论与结论

4.1 纯度测定中色谱系统的选择采用高效液相色谱法测定样品的纯度，一般需至少测定2种不同类型的色谱系统中的纯度，并将结果进行综合考量与计算。但由于苯甲磺酰截短侧耳素对照品仅在延胡索酸泰妙菌素含量测定过程中作为系统适用性对照品使用，故没有考察其他色谱系统纯度的必要性。因此，在本试验设计过程中，纯度测定的色谱系统仅选择了延胡索酸泰妙菌素的含量测定色谱系统。

4.2 单一波段下计算得出的纯度结果是否可以反映样品的色谱纯度上述纯度结果为212 nm波长下面积归一化法计算的结果。同时采集了供试品3D色谱图(图10)，发现除溶剂空白峰外，供试品仅在7.6 min附近有杂质，该杂质最大吸收亦接近212 nm。故212 nm下的纯度结果可以反映供试品的色谱纯度。