沙门氏菌类活疫苗活菌计数参考疫苗的研究

王秀丽，张媛，李红霞，袁露，李爱玲，曹翠萍，刘博，辛凌翔，彭国瑞，李建，蒋玉文*

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2. 齐鲁动物保健品有限公司，济南 250100；3. 辽宁益康生物股份有限公司，辽宁辽阳 111000)

沙门氏菌能感染多种动物，大部分沙门氏菌具有较强的致病性，成为肉类产品的主要污染源[1]。二〇一五版《中国兽药典》中收录的沙门氏菌类活疫苗有仔猪副伤寒活疫苗(C500株)、沙门氏菌马流产活疫苗、牦牛副伤寒活疫苗、牛副伤寒灭活疫苗等[2]。活菌计数是该类疫苗质量标准的重要参数，对于评价疫苗的安全性和免疫效力有重要意义；该类疫苗的效力检验(免疫攻毒法)也需要估计测毒及攻毒菌数。活菌计数受到多种因素影响，如培养基质量、培养条件、平板表面湿度、检验员的主观差异等，导致按照标准操作规程计数的结果不一致。在近几年的检验过程中，多次出现初次检验结果不符合规定，更换培养基或检验员重检后检验结果符合规定的情况，因目前没有活菌计数的参照物，对培养基的促生长能力及检验员的计数结果无科学评价的方法，重复检验降低工作效率，浪费实验材料。本研究试图研制沙门氏菌类疫苗活菌计数的参考疫苗，以期更加科学地评价沙门氏菌类疫苗活菌计数的结果。

1 材料与方法

1.1 参考疫苗候选物的制备及分发 按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》[3]的方法，制备一批(500瓶)仔猪副伤寒活疫苗(20头份/瓶)，作为参考疫苗候选物。按照现行《中国兽药典》三部对参考疫苗候选物的性状、纯粹检验、活菌计数、真空度测定、剩余水分等参数进行检验。从500 瓶参考疫苗候选物中随机抽取100 瓶，置于隔热泡沫塑料盒内，并放入生物冰袋，最外层包装纸箱，快递至A单位、B单位和C单位，收到样品后立即置于-70 ℃以下冰箱中保存[4]。

1.2 培养基及耗材 用6批原材料按《中华人民共和国兽用生物制品规程》二〇〇〇年版附录配制6批普通琼脂培养基，用上述培养基对随机抽取的3瓶参考疫苗候选物进行活菌计数，筛选出适宜的培养基原材料。用筛选出的原材料制备普通琼脂和普通肉汤培养基，用翻口胶塞密封后置于2～8 ℃保存。1 mL、10 mL一次性吸管购买自costar，一次性平皿(直径90 mm)，购买自青岛金典生化器材公司。A、B、C三家单位所用的试验耗材完全一致。

1.3 均一性试验 随机抽取10瓶参考疫苗候选物，由2名检验员对10瓶参考疫苗候选物同时进行活菌计数，计算每位检验员对10瓶参考疫苗计数结果的变异系数，比较2组数据的差异程度。

1.5 运输稳定性试验 B单位和C单位分别从100瓶参考疫苗候选物中随机抽取5 瓶用1.1项下的方式寄到A单位，A单位收到样品后马上进行活菌计数，运输过程均需2 d，分析运输过程对样品稳定性的影响。夏季(7月份)和冬季(12月份)分别试验一次。

1.6 加速破坏试验 随机抽取参考疫苗候选物，分别置于2～8 ℃、25 ℃、37 ℃、-20 ℃条件下，2～8 ℃、25 ℃、37 ℃条件下保存的样品每隔若干天随机抽取3瓶进行活菌计数、-20 ℃保存的样品每隔6个月随机抽取3瓶进行活菌计数，分析样品在不同储存条件下的稳定性[7]。

1.7 保存期试验 将置于-70 ℃以下保存的仔猪副伤寒参考疫苗候选物按1.4项下协作标定的方法每1～2个月取样并计数，至保存期18个月，对计数结果进行统计分析，每隔6个月对其性状、真空度、剩余水分测定一次。

1.8 参考疫苗的应用 2016-2018年沙门氏菌类活疫苗活菌计数的检验中，加入参考疫苗，每次检验随机抽取3瓶参考疫苗，其中至少2瓶参考疫苗计数结果在协作标定赋值范围内时对照成立，对待检疫苗进行结果判定。

2 结 果

2.1 参考疫苗候选物的检验 参考疫苗候选物性状为海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解，随机抽取5瓶疫苗进行纯粹检验，结果5/5纯粹生长，真空度测定结果显示疫苗呈现白色或粉色或紫色辉光，随机抽取4瓶疫苗测定剩余水分，结果为2.2%、2.3%、2.6%、2.1%，均小于3.0%，活菌计数结果为3.5×109CFU/头份。

2.2 培养基的筛选 由2名检验员用编号A～F的 6批普通琼脂培养基对相同的3瓶样品进行活菌计数。结果显示，6批普通琼脂培养基计数结果无差异，2名检验员计数结果基本一致(表1)。因此，随机选1批培养基的原材料配制普通琼脂培养基300瓶，100 mL/瓶，配制普通肉汤培养基400瓶，100 mL/瓶，均用翻口胶塞封口后置于2～8 ℃保存备用。

表1 参考疫苗用6批普通琼脂培养基计数结果Tab 1 Test result of the reference vaccines with 6 batches of normal agar mediums

表格中的2个数据分别为两名检验员的检测结果

2.3 均一性试验 结果显示，2名检验员对10瓶参考疫苗候选物计数结果的变异系数分别为8.4%和8.2%，均小于10%，说明均一性良好[8]，2名检验员对同一瓶疫苗计数结果的差异小于5.4%，说明检验员之间的计数结果差异不明显(表2)。

2.5 运输稳定性试验 第一次运输稳定性试验(夏季，7月份)：B单位和C单位寄回的5瓶参考疫苗候选物计数结果的最小值均为3.7×109CFU/头份，第二次运输稳定性试验(冬季，12月份)：B单位和C单位寄回的5瓶参考疫苗候选物计数结果的最小值分别为3.6×109CFU/头份，3.7×109CFU/头份。本参考疫苗候选物保存期0个月时计数结果为3.5×109CFU/头份，运输后计数结果与其一致，说明该参考疫苗候选物在48 h内的运输稳定性良好(表3)。

表2 均一性试验结果Tab 2 The uniformity test result

表3 运输稳定性试验结果Tab 3 The transport stability test result

表中数据为测定的菌数，单位为109CFU/头份

2.6 加速破坏试验 加速破坏试验结果(表4-表7)显示：2～8 ℃保存10 d，结果稳定，保存20 d菌数下降17%；25 ℃保存7 d，结果稳定，保存20 d，菌数下降22%；37 ℃保存5 d，结果稳定，保存7 d，菌数下降31%；-20 ℃保存的疫苗18个月内菌数无下降，结果稳定。

2.7 保存期试验 按协作标定的方法对-70 ℃以下保存18 个月以内的参考疫苗候选物逐月进行活菌计数，剔除结果不满意的偏离数据，变异系数为6.7%～8.9%，均小于10%，平均数为3.4×109～3.7×109CFU/头份，中位数为3.4×109～3.75×109CFU/头份，均在活菌计数可接受的误差范围内，且计数结果在18个月内未随保存时间的延长而降低，保存期为6个月、12个月、18个月时分别随机抽取参考疫苗候选物检查性状、真空度，结果均符合《中国兽药典》的规定[9]，剩余水分均小于3%。

表4 参考疫苗候选物加速破坏试验(2～8℃)Tab 4 The accelerated damage test of the candidate reference vaccines(2～8℃)

表5 参考疫苗候选物加速稳定性试验(25℃)Tab 5 The accelerated damage test of the candidate reference vaccines(25℃)

2.8 参考疫苗的应用 本参考疫苗在应用过程中主要存在4种情况：(1)参考疫苗对照成立，待检疫苗不符合规定，这种情况下更换培养基，由2名检验员同时对待检疫苗进行重检，检测结果均与初次检验结果一致。(2)待检疫苗和参考疫苗结果均不符合规定，更换培养基对待检疫苗和参考疫苗重检测，参考疫苗结果符合规定，对待检疫苗进行判定。(3)参考疫苗符合规定，待检疫苗不符合规定，但二者在37 ℃培养24 h菌落大小不一，继续延长培养时间仍有新菌落长出，且菌落直径总体小于本菌在37 ℃培养24 h的大小。(4)待检疫苗和参考疫苗均符合各自质量标准(表8)。

3 结论与讨论

在生物制品的检验中增加参考品以更加客观、科学的评价检验结果是未来的一种趋势，国外以及国内人用生物制品参考品的研究及应用越来越广泛[10-11]。活菌计数是细菌类活疫苗质量控制最重要的参数之一，直接关系到疫苗的安全性和免疫效力，参考疫苗的研究对于客观评价疫苗的菌数有极其重要的意义。目前我国尚无任何活菌计数的参考疫苗，也无控制培养基促生长能力的参考疫苗，对影响活菌计数结果的关键因素之一培养基的质量无法科学评价，外加其他因素的影响，更无法科学评价活菌计数结果的有效性。活菌计数的参照物在美国细菌类疫苗如多杀性巴氏杆菌和猪丹毒杆菌活疫苗的检验中已应用多年[12-13]，但其应用和判定不适合中国国情。

表6 参考疫苗候选物加速稳定性试验(37℃)Tab 6 The accelerated damage test of the candidate reference vaccines(37℃)

表7 参考疫苗候选物加速稳定性试验(-20℃)Tab 7 The accelerated damage test of the candidate reference vaccines(-20℃)

通过对沙门氏菌类活菌计数参考疫苗的系统研究，制定出参考疫苗的质量标准：性状、纯粹检验、真空度测定、剩余水分测定的标准参照《中国兽药典》；活菌计数标准为随机抽取3瓶参考疫苗，至少有2瓶计数结果在参考疫苗协作标定赋值范围内，且在37 ℃培养24 h，菌落大小均匀一致； 均一性检验标准为随机抽取10瓶参考疫苗进行活菌计数，10瓶参考疫苗计数结果的变异系数小于10.0%；运输稳定性标准为将参考疫苗置于2～15 ℃运输不超过48 h，活菌数下降应小于10.0%。

表8 参考疫苗的应用情况Tab 8 The preliminary application of the reference vaccine

参考疫苗换批时需对现有的在保存期内的参考疫苗用普通琼脂进行计数，如果计数结果符合参考疫苗的质量标准，说明普通琼脂培养基的灵敏度适宜，用该普通琼脂培养基对新制备的参考疫苗进行检验和协作标定，以确保参考疫苗在换批时标准一致[14]。

参考疫苗的应用结果显示，本参考疫苗既可以应用于控制沙门氏菌类活疫苗活菌计数的过程，又可以用于控制普通琼脂培养基的质量。控制沙门氏菌类活疫苗活菌计数的过程时，每次检验均需使用参考疫苗对试验结果的有效性进行判定。若一次检验中使用同一批普通琼脂培养基对多批次检品进行检验，则仅需要使用3瓶参考疫苗对试验结果的有效性进行判定。若一次检验中使用了不同批次的普通琼脂培养基，则每批次普通琼脂培养基均需用3瓶参考疫苗对试验结果进行有效性判定。当3瓶参考疫苗中至少2瓶计数结果在参考疫苗质量标准规定的范围内，且(37±0.5) ℃培养18～24 h菌落大小均匀一致时，判定试验结果有效。此时将每批待检疫苗3瓶样品中含有活菌数的最小值计为检验结果，根据制品质量标准进行判定。用于普通琼脂培养基质量控制时，每批普通琼脂培养基用3瓶参考疫苗进行检验，当不少于2瓶参考疫苗计数结果在参考疫苗协作标定范围内，且参考疫苗在(37±0.5)℃培养18～24 h，菌落大小均匀一致时，判定培养基促生长能力符合规定。若参考疫苗计数结果高于参考疫苗协作标定的赋值范围，提示普通琼脂培养基的促生长能力偏高，若低于参考疫苗协作标定的赋值范围，提示普通琼脂培养基的促生长能力偏高。因此应在普通琼脂培养基质量标准的控制中添加促生长能力检验参数，符合规定的培养基用于检验，可以避免不必要的重复工作。若参考疫苗在普通琼脂培养基的质量控制中应用后还可以降低普通琼脂培养基促生长能力的批间差异，在效力检验(攻毒保护试验)估算菌数时即使更换培养基，对结果影响不大，保证试验的顺利进行。