肺炎链球菌新型疫苗研发进展

邓谢淑婷 刘兴隆 周璇 袁竹 孙滋蔚 吴海燕

(1. 四川大学华西临床医学院；2. 四川大学华西基础医学与法医学院药理教研室，四川 成都 610041)

1 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，Spn)的分类及其感染

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，Spn)是一种有荚膜的革兰阳性双球菌，可按荚膜多糖组成成分的不同对其进行血清型分型。截止至2013年，世界范围内已出现90多种不同的血清型，且其分布具有很强的地域性和时间性[1]。

肺炎链球菌感染可引起中耳炎、鼻窦炎等呼吸道粘膜疾病，若细菌入血可能会引起更严重的侵袭性肺炎球菌疾病(Invasive pneumococcal diseases，IPD)[2]，在发展中国家，每年大约有1450万婴儿患有严重的肺炎球菌疾病，并在全球范围内造成了100多万人的死亡[3]。根据其感染的机制，人们不断地开发出得以应对的治疗方法。例如，肺炎链球菌在鼻咽部定植之前需与此处的常驻微生物群竞争从而取得繁殖优势。有研究显示，细胞因子白介素-17(IL-17)可以预防肺炎链球菌鼻腔定植的发生[4]，其抵抗肺炎链球菌定植的机制可能是由于它所驱动的鼻腔微生物群组成的变化[5]，且它的保护作用依赖于细菌侵袭力和荚膜厚度：对于高侵袭性薄荚膜的肺炎链球菌，IL-17具有更强的保护作用[6]。总之，随着更多研究的开展，肺炎链球菌感染机制的研究得以不断深入，为疾病的预防与治疗提供了新思路。

2 传统多糖疫苗

荚膜多糖疫苗是目前预防肺炎链球菌感染最主要应用的疫苗，并且儿童和成人所接种的多糖疫苗种类不同，应用于儿童的主要是7，10和13价肺炎球菌结合疫苗(PCV-7，-10，-13)，而应用于成人的是23价肺炎球菌纯多糖疫苗(PPV-23)。但随着大面积的投入使用，多糖疫苗显示出了一定的局限性。除了其生产的高成本，无法诱导二次免疫应答，有限的血清型覆盖率[7]等原因之外，近期有地区监测研究显示，在引入PCV-13国家免疫计划后，非疫苗血清型(Non-vaccinetypes，NVT)与其所致的侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)比例有所增高[8]，这对多糖疫苗的保护作用提出了更大的考验。总之，我们需要寻找新的疫苗，以便能对更广泛的肺炎链球菌菌株提供更经济的防护。

3 新型疫苗的开发

新型肺炎链球菌疫苗的研发需要考虑合适的疫苗抗原、佐剂和递送载体。目前处于研究阶段的新型疫苗抗原候选物主要为以下三种：蛋白质疫苗、全细胞疫苗和DNA疫苗。

3.1 蛋白质疫苗

由于在不同血清型菌种间较保守的结构组成，蛋白质抗原在肺炎链球菌疫苗中的应用是人们在新疫苗开发中重要的突破口。目前此种疫苗在研究中取得了较大进展，在此我们主要讨论以下三种：肺炎球菌溶血素(Pneumolysin，Ply)、肺炎球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface proteinA，PspA)和肺炎球菌表面蛋白C(Pneumococcal surface protein C，PspC)。

3.1.1肺炎球菌溶血素

由于肺炎球菌溶血素(Pneumolysin，Ply)具有细胞毒性，不能以原型直接作为疫苗组成成分，需对其结构中的某些氨基酸位点进行修饰，从而产生低毒性的衍生物，方可加入到疫苗中。变异的溶血素衍生物虽然毒性降低，但仍保留了原溶血素的免疫原性与免疫反应性。最近，一项研究测定了一种溶血素衍生物在小鼠体内免疫反应的T细胞表位(如表1)，并发现其与通过计算机预测出来的该衍生物在人体中的T细胞表位具有相当大的重叠。如果小鼠中鉴定出的T细胞表位也可以在人体中得到证实，这些表位中具有一定序列的氨基酸将可作为新型疫苗的重要组成成分。

表1 溶血素衍生物PlyD1中的T细胞表位[9]

注：划线部分为免疫优势T细胞表位，即引起最强的T细胞反应；其余为亚优势T细胞表位。

3.1.2肺炎球菌表面蛋白A

肺炎球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface proteinA，PspA)是一种胆碱结合表面蛋白，其干扰补体成分C3在肺炎球菌细胞表面的固定，从而抑制补体介导的细胞毒作用，以促进细菌的免疫逃避。在小鼠实验中，PspA显示出对肺炎链球菌所致的脓毒症、肺炎的保护作用[10]。值得注意的是，PspA的N-末端区域由重复的α端螺旋结构组成，其长度和氨基酸序列可变，虽然针对此区域的抗体具有一定的交叉保护性，但当疫苗所包含的PspA和攻击菌株的PspA具有相同的α螺旋结构时，疫苗体现出最强的保护作用[11]，因此我们可以在疫苗开发中加入一种以上的PspA，以增强疫苗的覆盖率。

3.1.3肺炎球菌表面蛋白C

肺炎球菌表面蛋白C(Pneumococcal surface protein C，PspC)可促进肺炎链球菌对鼻咽部上皮细胞的粘附，它的结构中具有和PspA相似的PR区域，即蛋白质N-末端和C-末端之间的一段富含脯氨酸的保守氨基酸序列，故针对PspC的抗体可以同时显示出对PspA的交叉保护作用[12]。

值得注意的是，肺炎链球菌在正常情况下为鼻腔部的微生物共生体，完全消除定植于鼻腔部的全部肺炎链球菌是难以实现甚至是有害的，因此确定肺炎链球菌由正常共生体转化为致病菌的定植量的界值是研究人员目前面对的挑战；另外，肺炎链球菌与其他上呼吸道细菌和病毒以及共生菌群之间具有协同或拮抗相互作用[13]。例如，一些上呼吸道细菌和病毒的感染是使肺炎链球菌转化为病原体的潜在因素，目前已有研究证明了流感病毒和肺炎链球菌 之间的协同作用[14]，因此对于一些没有针对甲型流感常规免疫计划的国家，其鼻咽部的微生物负担增加，可能会影响疫苗的效力；另一方面，肺炎链球菌与鼻腔部中某些菌种之间具有拮抗关系。有研究显示，肺炎链球菌定植的减少会导致人体内金黄色葡萄球菌携带率的增加[15]，因此在引入肺炎链球菌蛋白疫苗前，我们需要考虑肺炎链球菌和与其具有拮抗关系菌种之间的平衡变化。此外，有研究显示，在一些具有高肺炎链球菌细菌负荷的国家，疫苗可能难以体现出预期的保护作用，原因可能是长期的高浓度抗原环境导致的CD4+T细胞功能的部分丧失进而影响B细胞分化成抗体分泌细胞的过程[16]。因此，在未来蛋白质疫苗的开发与推广过程中，我们需要考虑不同地区的免疫应答因素。

3.2 全细胞疫苗

全细胞疫苗(Whole cell vaccine，WCV)也是有力的新疫苗开发候选物[17]。将减毒或灭活的肺炎链球菌菌体整个注入到宿主体内，为免疫协同应答提供了多个作用靶点，并且其生产的低成本也为在发展中国家的推广创造了条件。目前批准应用的全细胞疫苗主要为铝佐剂肺炎球菌疫苗，其抗原为荚膜阴性的减毒肺炎球菌突变体，并通过加入氢氧化铝以增强其免疫反应。对于此种疫苗，推荐使用注射给药。目前美国正在进行全细胞疫苗临床试验的第一阶段研究以探究其安全性与免疫原性。但是全细胞疫苗目前仍存在很多隐虑。首先，处理后的肺炎球菌所提供的抗原位点并不是均对免疫防御具有正性协同作用，有些特定组合的抗原可能会干扰疫苗的保护作用；其次，减毒菌株在体内逆转为致病状态的可能性仍令人担忧；此外，由于疫苗的保护效力受到灭活方法、给药途径和免疫途径等多因素的影响，因此我们仍然需要进行更多的研究去探索其最佳的制造与应用方法。

3.3 DNA疫苗

DNA疫苗目前仍处于研究探索阶段。一项研究显示，将编码攻击菌株表面蛋白A的DNA序列注射至小鼠体内，其诱导的保护作用的水平与直接注射纯化蛋白质所诱导的相似[18]，这为DNA抗原在疫苗开发中的应用提供了实验依据。DNA疫苗易于制造、成本低、运输稳定，这些特性使其成为在发展中国家推广的理想选择。但裸露的质粒DNA仅诱导较弱的免疫应答，这可能与其在粘膜表面的降解有关。因此为了构建有效的DNA疫苗，我们需要选择合适的DNA递送系统。有研究显示，壳聚糖作为天然可生物降解的多糖可与DNA分子络合形成纳米粒子，从而提高疫苗递送的能力，增强其所诱发的免疫应答反应[19]，这为日后DNA疫苗的开发在递送系统的选择上提供了启示。

3.4 疫苗的其他组成成分

除了疫苗抗原外，佐剂也是疫苗中重要的组成成分，它是能够改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答、发挥辅助作用的一类物质。选择合适的佐剂是新疫苗开发成功的关键。如将全细胞疫苗以鼻内用药方式作用于粘膜免疫时可以加入霍乱弧菌作为佐剂以增强其减少细菌鼻咽定植的保护作用。其增强粘膜免疫的机制可能与上呼吸道抗肺炎球菌粘膜分泌型IgA抗体的产生增加有关[20]。

此外，新疫苗的开发还需要选择合适的载体。例如，乳酸菌是我们生活中常用的一种细菌，有研究显示，将可产生肺炎球菌毒力蛋白的重组乳酸菌注入到小鼠体内时，可诱导血清中相关抗体的生成，并且作为益生菌，其对人体的健康伤害较小，体现了它作为疫苗递送载体的巨大潜力[21]。

综上所述，虽然目前针对新疫苗的开发仍然存在许多未解决的问题，但是不可否认的是，新的疫苗的出现是符合当今疫苗使用趋势的。有研究显示，对于未接种人群，不同血清型的肺炎链球菌所致疾病的发病率都遵循的几乎相同的年龄变化分布曲线(见图1)，说明机体针对肺炎链球菌的免疫并不是血清依赖性的，可能存在一种共同的机制将各种血清型作为一个整体进行免疫防御，这为开发非血清依赖性的新疫苗提供生理学依据。

图1 不同荚膜血清型引起的侵袭性肺炎球菌疾病的年龄特异性发病率[22]

在“超级细菌”势头迅猛的今天，肺炎链球菌对常规疫苗敏感性的下降令人担忧。我们不得不在已有的预防方法基础上探索新的便于生产、更为高效的疫苗。幸运的是，聚合酶链式反应和高通量全基因组测序等多种新兴测序技术的发展为我们在分子水平上认识和应对肺炎链球菌提供了巨大帮助。

蛋白质疫苗、全细胞疫苗和DNA疫苗在全新的方向上为新型疫苗的研制提供了选择。蛋白质疫苗是最早进入我们视野的新型疫苗候选物，将其与多糖缀合从而研发出的肺炎球菌结合疫苗是市场上应用最广的肺炎链球菌疫苗。目前研发蛋白质候选疫苗最普遍和最全面的方法之一是在疾病自然感染阶段的人血清中筛选具有强烈反应性的抗原。此种方法已经为我们确定了多种肺炎链球菌蛋白疫苗候选物，目前围绕这些候选物的相关研究正在积极开展。生产全细胞疫苗的技术要求程度低且成本不高，为其在发展中国家的推广创造了条件。然而以全细胞作为疫苗的抗原仍然存在许多问题，如抗原之间的干扰作用，细胞在体内的逆转可能性等，另外，寻找合适的佐剂和灭活方法也是全细胞疫苗在应用和推广过程中的挑战。DNA疫苗仍处在研究探索阶段，目前还未有较多的文献记载其在人体临床试验中的相关成果，但不可否认的是，此研究方向存在巨大的潜力。