水飞蓟宾改善APP/PS1双转基因小鼠认知能力氧化应激相关机制研究

张礼茜，陈雪莹，范碧莲，李文博，殷浩然，顾子琨，崔岩，袁月鸣，孟禹彤，方叶，金戈

（1.沈阳医学院基础医学院临床医学专业2015、2016级，辽宁 沈阳 110034；2.公共卫生学院预防医学专业2015级；3.基础医学院药理学教研室）

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是痴呆的一种常见类型，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍［1］。全球现有3 500多万痴呆患者，每年新增病例460万。65岁以上老年人的发病率每5年翻一番。到2040年，全球痴呆病例将达到8 110万［2］。AD成为目前危害老年人健康最常见的疾病之一，给家庭带来沉重的精神及经济负担。然而目前治疗AD的药物有限，获得美国FDA批准的临床药物包括胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂等［3］。因此，研发新的治疗AD的药物十分迫切。从中药天然产物中筛选安全、有效、多靶点的药物为AD治疗提供新思路成为研究热点。水飞蓟宾（silibinin）是菊科植物水飞蓟果实中提取的黄酮木脂类化合物的最主要成分，临床上用于治疗急慢性肝炎、肝硬化及中毒性肝损伤［4］。有文献报道水飞蓟宾能够改善学习记忆障碍，但机制尚未明确。本研究采用APP/PS1双转基因小鼠进一步评价水飞蓟宾提高学习记忆能力及探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 6月龄APP/PS1双转基因小鼠，雄性，体重（30±2）g，由北京华阜康生物技术有限公司提供，实验动物合格证号：SCXK（京）2014-0004。将实验动物按体重随机分为模型组、美金刚组、水飞蓟宾低和高剂量组；另选取平行月龄C57BL/6J小鼠为空白对照组，每组10只。实验动物饲养环境温度22～24℃，湿度60%左右，自由摄食饮水，12 h循环光照。实验动物适应性喂养1周后。空白对照组和模型组给予生理盐水，美金刚组给予2.6 mg/kg美金刚，水飞蓟宾低、高剂量组分别给予100 mg/kg、200 mg/kg水飞蓟宾，每天灌胃一次，连续灌胃给药6周余，行为学实验时期继续给药。

1.2 药品及试剂 水飞蓟宾（湖南协力药业有限公司，批号20130804）；美金刚（丹麦灵北药厂，进口药品注册证号H20120268）；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，E-EL-0026c、E-EL-0060c、EEL-M2398c）；突触素（synaptophysin，SYP）、生长 相 关 蛋 白（growth-associated protein 43，GAP-43）ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）。

1.3 仪器及装置 Morris水迷宫装置及检测分析系统（成都泰盟软件有限公司）；酶标定量测试仪（奥地利特TECAN公司）；-80℃低温冰箱（中科美菱）；低温超速离心机（美国BECK⁃MAN公司）；机械匀浆机（上海净信科技公司）；透射电镜（日本电子株式会社）。

1.4 方法

1.4.1 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫实验装置为一个直径为100 cm白色圆形水池及一个直径约10 cm的安全平台。水温22～24℃。实验分为三部分：（1）适应环境，在无安全平台的情况下每只小鼠自由探索1 min。（2）定向航行：将安全台放置在第四象限，将小鼠从不同入水口放入水中，电脑同时进行数据采集并记录其找到安全平台的时间（逃避潜伏期），小鼠在安全平台停留5 s后采集自动停止。数据采集时间为60 s，小鼠每天训练2次，连续训练5 d。（3）空间探索：定向航行试验结束后，撤除安全平台，将小鼠放入水池中，自由探索60 s，第6天进行。摄像系统在规定时间内记录小鼠在安全平台所在象限游泳的时间、路程及穿越安全平台所在位置的次数等指标。本研究采用定向航行游泳距离、空间探索目标象限停留时间百分比分析水飞蓟宾改善学习记忆障碍的作用。

1.4.2 ELISA 法检测小鼠脑皮质组织中 MDA、GSH、SOD含量 将小鼠脑皮质组织10～20 mg以1∶10的体积比加入磷酸盐缓冲液，组织匀浆；3 000×g离心2次，每次10 min，取上清液。按照ELISA试剂盒说明书操作，检测MDA、GSH、SOD含量。

1.4.3 电镜下观察小鼠突触的超微结构 将小鼠脑海马组织固定后进行脱水包埋，先用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次5 min；然后用1%锇酸固定液固定后，经梯度酒精、丙酮处理后包埋。将包埋后的组织样本进行固化，超薄切片机切片50 nm，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜下观察。

1.4.4 ELISA法检测小鼠脑皮质组织中突触相关蛋白SYP、GAP-43的表达 组织处理同1.4.2。具体按照ELISA试剂盒说明书操作，检测SYP、GAP-43的表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用最小显著性差异法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水飞蓟宾对APP/PS1小鼠水迷宫实验游泳距离及目标象限停留时间百分比的影响 与对照组比较，模型组小鼠的游泳距离显著增加（P＜0.05），目标象限停留时间百分比显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，水飞蓟宾100 mg/kg、200 mg/kg组及美金刚组小鼠游泳距离显著减少，目标象限停留时间百分比显著增加（P＜0.05）。见表1。

表1 水飞蓟宾对APP/PS1小鼠Morris水迷宫游泳距离及目标象限停留时间百分比的影响（n=10）

2.2 水飞蓟宾对APP/PS1小鼠脑皮质组织中MDA、GSH和SOD含量的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠脑皮质组织中MDA含量显著升高，SOD和GSH含量显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，水飞蓟宾组小鼠脑皮质组织中的MDA含量显著降低，水飞蓟宾200 mg/kg组SOD和 GSH含量显著增加（P＜0.05），水飞蓟宾 100 mg/kg组GSH含量显著增加（P＜0.05）。见表2。

表2 水飞蓟宾对APP/PS1小鼠脑皮质组织中MDA、GSH和SOD含量的影响（n=5）

2.3 水飞蓟宾对APP/PS1小鼠突触超微结构的改善作用 透射电镜下观察发现，对照组突触数量较多，突触前膜内突触小泡含量丰富，突触间隙清楚，突触后致密物厚度较大且均匀。与对照组比较，模型组突触数量减少，突触结构模糊，前后膜融合，小泡含量较少，突触后致密物厚度较薄。与模型组相比，水飞蓟宾200 mg/kg组突触数量较多，突触结构较为清晰，突触间隙明显，可见丰富的突触小泡和较厚的突触后致密物。见图1。

2.4 水飞蓟宾对APP/PS1小鼠脑皮质组织中突触相关蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组小鼠脑皮质组织中SYP和GAP-43蛋白表达含量均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，水飞蓟宾低、高剂量组脑皮质组织中SYP以及水飞蓟宾200 mg/kg组GAP-43蛋白表达含量均显著升高（P＜0.05）。见表3。

图1 透射电镜下水飞蓟宾对APP/PS1小鼠脑突触超微结构的改善作用（×20 000）

表3 水飞蓟宾对APP/PS1小鼠脑皮质组织中突触相关蛋白表达的影响（n=5）

3 讨论

水飞蓟素主要含有水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟亭及水飞蓟宁等活性成分，其中，以水飞蓟宾活性最强、含量最高。研究显示，水飞蓟素能消除体内活性氧，对抗脂质过氧化、肝纤维化，是各种病毒性肝炎、肝纤维化、酒精性肝损害以及其他中毒代谢性肝损害的有效治疗药物。水飞蓟素可以显著改善海马注射Aβ1-40大鼠学习记忆障碍，通过降低APP表达，抑制Aβ斑块的形成［5-6］；抑制LPS诱导脊髓小胶质细胞分泌iNOS［7］。氧化应激能够通过增加APP的表达，调节β分泌酶和γ分泌酶的活性，促进Aβ的生成。Aβ寡聚体能促进Tau蛋白的磷酸化，形成神经原纤维缠结（NFT）。Aβ在胞外沉积形成的老年斑（SP）和NFT会进一步促进氧化应激反应并延长炎症反应，对神经元造成不可逆的损伤并最终导致神经元的死亡［8-9］。突触作为神经元之间信息传递的结构基础，具有改变其长度和结构的能力，称为突触可塑性，是脑内学习和记忆的神经生物学基础［10］。SYP是突触囊泡最丰富的蛋白之一，超过90%的突触囊泡都含有SYP，可作为反映突触密度的标志［11］。SYP在突触囊泡转运、与突触前膜锚靠、融合并释放神经递质中起重要作用。SYP能够促进囊泡离开网状细胞骨架，移向突触前膜并与之融合。SYP对钙离子依赖性的神经递质（乙酰胆碱和谷氨酸等）的释放过程中起着重要作用［12-13］。AD患者SYP减少与认知功能下降密切相关［14-15］。GAP-43对神经发育、轴突的再生、突触的发生、信号传导及神经递质的释放均起着重要作用［16-17］。神经损伤后轴突再生和反应性突触形成都伴随着GAP-43表达增加，GAP-43可作为突触可塑性的一个标志物［18］。Morris水迷宫实验是行为药理学中最常用的测试方法之一，常被用来评估啮齿类动物的空间学习记忆能力［19-20］。文献报道水飞蓟宾显著减少AD模型小鼠逃避潜伏期及游泳距离［19］。

本实验结果显示，水飞蓟宾可显著改善APP/PS1小鼠Morris水迷宫空间探索中游泳距离、定向航行目标象限停留时间百分比等指标。形态学结果显示水飞蓟宾200 mg/kg能够显著修复突触超微结构损伤的作用；另外，水飞蓟宾200 mg/kg可促进突触相关蛋白SYP、GAP-43的表达，减少APP/PS1小鼠脑中脂质过氧化产物MDA含量，增加SOD及GSH的含量，抑制氧化应激。水飞蓟宾改善APP/PS1小鼠学习记忆障碍的机制可能与促进抗氧化应激因子的表达，改善突触结构和功能相关。