谷氨酸代谢转运障碍和氧化损伤在甲基汞神经毒性中的交互作用及其分子机制

徐兆发

（中国医科大学公共卫生学院环境卫生学教研室，辽宁 沈阳 110122）

自20世纪50年代发现甲基汞（methylmercury，MeHg）污染可导致“水俣病”发生以来，环境汞污染所致的人体健康危害已引起人们极大关注。汞是除温室气体外，唯一可在全球范围产生影响的化学物质。我国是目前世界上用汞量最大的国家，也是全球范围汞污染最为严重的区域。污染水体的汞，特别是在底泥中的汞，在微生物的作用下可被甲基化形成MeHg，其毒性较无机汞增大许多倍，极易为生物体吸收，并可通过水系生物的食物链在生物体内逐渐富集，致使某些水生生物体内汞含量达到使人产生中毒的水平。当前，MeHg的环境污染已经成为全球性的重大环境问题。慢性MeHg中毒是由于长期食用被MeHg污染水体中的鱼贝类食物，导致体内MeHg蓄积，并超过一定阈值引起以神经系统损害为主的疾病［1］。MeHg神经系统损害的主要部位是大脑的枕叶（距状区视觉中枢）和小脑组织［2］。尽管对MeHg致神经损害这一长期而现实的问题已经进行了多年的研究，但MeHg神经毒性的作用机制至今没有完全阐明，依然是各国学者研究的热点。本研究就谷氨酸代谢转运障碍和氧化损伤在MeHg神经毒性中的交互作用及其分子机制进行综述。

1 谷氨酸代谢转运障碍

随着对脑内兴奋性氨基酸（excitatory amino acid，EAA）神经递质及其受体研究的不断深入，EAA所致兴奋性毒性的阐明，发现兴奋性毒性在多种神经损害的发病机制中起着重要的作用［3］。谷氨酸（glutamate，Glu）是哺乳动物脑内最重要的兴奋性神经递质，通过正常状态的代谢转运通路，可维持突触间隙Glu浓度的恒定。神经胶质细胞生成的谷氨酰胺（glutamine，Gln）通过细胞间隙运送到神经元内，经过磷酸活化的谷氨酰胺酶（phosphate activated glutaminase，PAG）水解生成Glu。同时，一部分Glu经谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）催化生成具有抑制作用的γ-氨基丁酸（g-aminobutyric acid，GABA）。Glu通过ATP依赖性的H+离子梯度偶联机制被运送到突触囊泡中，随着神经末梢的去极化和囊泡突触后膜融合，Glu被释放到突触间隙。正常状态下只有1/4的Glu与突触后膜受体结合发挥其生理作用。因为在中枢神经系统，突触间隙不存在Glu代谢酶，所以大部分Glu被位于突触前膜和星形胶质细胞膜上的兴奋性氨基酸转运体（EAA transporter，EAAT）重摄取。目前已克隆出5种位于细胞膜的高亲和力的EAAT［4］，包括谷氨酸-天冬氨酸转运体（glutamate-aspartate transporter，GLAST/EAAT1）、谷 氨 酸 转 运 体 1（glutamate transporter1，GLT-1/EAAT2）、EAAC1/EAAT3、EAAT4和EAAT5。EAAT主要位于星形胶质细胞和神经元的细胞膜上（GLAST和GLT-1在星形胶质细胞，EAAT3、EAAT4和EAAT5在神经元）。GLAST和GLT-1对Glu的亲和力远远高于其他类型的Glu转运体，所以清除突触间隙积聚的Glu，防止兴奋性毒性主要由星形胶质细胞膜上的GLAST和GLT-1完成［5-6］。大量的Glu被转运到星形胶质细胞中，Glu在星形胶质细胞内通过谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）的作用转变生成Gln，Gln再经过突触间隙被运回到神经元，构成Glu-Gln环路。EAAT传递功能正常时，脑组织不会受到Glu神经毒性的损害。哺乳动物脑内主要兴奋性神经递质Glu的受体，分为离子型Glu受体（ionotropic glutamate receptors，iGluRs）和代谢型Glu受体（metabotropic glutamate receptors，mGluRs）。根据配体的不同将离子型Glu受体分为N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid，AMPA）受体和红藻氨酸（kainate receptors，KA）受体。NMDA 受体是由 NMDAR1、NMDAR2A～2D和NMDAR3A～3B亚单位组成的异聚体。其中NMDAR1亚单位是NMDA受体的功能单位。AMPA/KA受体与配体结合后打开离子通道，Na+和K+作跨膜移动，引起神经细胞膜去极化。继而NMDA受体通道开放，Ca2+离子可通过NMDA受体的离子通道［7］。细胞间隙Glu过量堆积可导致神经毒性。已有研究指出MeHg中毒可能发生Glu递质传递紊乱［8-9］，MeHg可以使细胞突触间隙Glu含量增加［10-13］，从而造成Glu堆积，引发神经毒性。

2 氧化损伤

大量研究表明，氧化应激参与神经系统疾病的发生与发展。核转录因子NF-E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2）是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子，生理状态下与胞浆蛋白伴侣分子Keap1（Kelch-like ECH-associated protein1）偶联并与胞浆肌动蛋白结合被锚定在胞浆，同时Keap1通过泛素化途径介导了Nrf2的快速降解，维持Nrf2在细胞内的稳定。在氧化应激源作用下，Nrf2与Keap1解偶联并转移入核，与Maf蛋白结合成异二聚体后识别并与抗氧化反应元件ARE（antioxidant response element）上GCTGAGTCA位点结合，启动ARE调控的Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因表达，提高细胞抗氧化应激能力［14-15］。Nrf2作为转录因子与抗氧化反应元件ARE作用，调控ARE依赖的第Ⅱ相解毒酶基因和抗氧化酶基因的转录活性，包括谷胱甘肽S转移酶（glutathione Stransferases，GSTs）、NAD（P）H醌类氧化还原酶1（NAD（P）H quinine oxidoreductase 1，NQO1）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide sismutase，SOD）、血红素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）和 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（gamma-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）等［16］。Nrf2-Keap1-ARE系统作为细胞内最重要的抗氧化应激调控通路，在中毒性神经损害过程中具有重要的细胞保护作用。Nrf2缺失或激活障碍，会引起细胞对应激源的敏感性增高，加重氧化应激源的细胞毒性，导致细胞功能障碍、细胞凋亡甚至死亡［17］。有报道指出MeHg中毒所致的神经损害与活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）有关［18］，ROS是细胞过氧化损伤的起始因子，过氧化反应一旦启动，即可通过自由基链式反应导致其终产物水平升高而致氧化损伤。MeHg也可影响Nrf2-Keap1-ARE系统，MeHg和Keap1结合，激活Nrf2-ARE信号通路，使其下游的抗氧化基因上调［19-21］。

3 谷氨酸代谢转运障碍和氧化损伤的交互作用

虽然有研究指出在MeHg中毒可能发生Glu递质传递紊乱，MeHg可以使细胞突触间隙Glu含量增加。也有研究指出MeHg可影响Nrf2-Keap1-ARE系统，MeHg所致的神经损害与氧化损伤有关，但没有对Glu代谢转运障碍和氧化应激在MeHg神经毒性中的交互作用进行深入系统的研究。为了探讨MeHg对Glu代谢转运和氧化应激及Nrf2-ARE通路影响，进而发现Glu代谢转运障碍和氧化应激在MeHg神经毒性中的交互作用，我们研究团队通过大鼠整体实验和体外神经胶质细胞和神经原培养，观察了11种物质预处理对MeHg致神经毒性的影响。

3.1 非竞争性NMDA受体拮抗剂

3.1.1 地卓西平马来酸盐（dizocilpine maleate，MK-801） MK-801易通过血脑屏障，可作用于NMDA受体通道内部的苯环哌啶位点进行别构调节，能有效阻止Glu与突触后膜受体结合，阻断NMDA受体偶联的Ca2+通道激活，使Ca2+内流减少，从而使NMDA受体作用减弱，对Glu兴奋毒性起拮抗作用［22-23］。

3.1.2 盐酸美金刚胺（memantine hydrochloride，MEM） MEM是一种低亲和力、非竞争性的NMDA受体拮抗剂，能够抑制由于NMDA受体受到的慢性过度刺激而引起的Ca2+内流［24］。并且，由于MEM的低亲和力，在抑制Glu导致的NMDA受体病理性激活所致兴奋性毒性的同时，不妨碍NMDA受体生理性激活参与正常兴奋性传递的功能［25］。

3.1.3 右美沙芬 右美沙芬具有脂溶性，较易通过血脑屏障［26］，能有效拮抗Glu引起的兴奋性毒性，对化学物质引起的神经毒性有一定的保护作用［27］。

3.2 Glu释放抑制剂 利鲁唑（2-氨基-6-三氟甲氧基-苯并噻唑，Riluzole）已经作为Glu释放抑制剂被用于治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症［28］。国内外许多研究者探讨了利鲁唑在神经保护方面的作用及机制，结果表明利鲁唑既是一种Na+通道阻断剂，又是一种Glu调节剂，作用机制可能与其影响多种受体和离子通道功能相关［29］。已有研究证明，利鲁唑具有促进Glu摄取［30］，抑制 Glu从神经末梢释放［31］，增加 Glu与其转运体的结合活力等作用［32］，对Glu兴奋性毒性损伤有明显的防护作用［33］。

3.3 抗氧化物质

3.3.1 牛磺酸（Taurine） 牛磺酸作为一种含硫的β-氨基酸磺酸类似物，是一种内源性抗氧化剂。在中枢神经系统的含量很丰富，具有维持渗透压平衡、保护细胞膜、抗氧化应激等广泛生物效应［34］。

3.3.2 N- 乙 酰 半 胱 氨 酸（N-acetyl cysteine，NAC） NAC是一种含巯基的抗氧化剂，有干扰自由基生成，清除已生成的自由基作用。NAC作为还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）的前体，在体内可以转化为GSH发挥对组织的保护作用［35］。

3.3.3 α-硫辛酸（Alpha-Lipoic acid，α-LA） α-LA是一种抗氧化剂，与其代谢产物DHLA联合可清除生物体内多种活性氧，并可激活生物体内其他抗氧化物质的代谢循环，共同发挥生物抗氧化作用［36-37］。

3.4 植物提取物（为实际应用提供实验依据）

3.4.1 茶多酚 茶多酚是茶叶中所含有的多羟基类化合物的总称，有强大的抗氧化与抗衰老能力，可有效清除人体内过剩的活性氧自由基，抑制过氧化反应。

3.4.2 原花青素 原花青素是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮，广泛存在于我国大自然植物中，如葡萄、山楂、银杏等，具有抗氧化和清除自由基、抗炎作用、保护肝肾功能、抑制肿瘤细胞生长等作用。

3.4.3 莱菔硫烷 莱菔硫烷是从十字花科蔬菜中提取出来的一类异硫氰酸盐，具有增强抗氧化、提高免疫能力、抗突变和抗肿瘤的能力。其机制是通过诱导转录因子Nrf2而激活抗氧化反应元件ARE调节的Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因。

3.4.4 姜黄素 姜黄素是从姜科植物的根茎姜黄中提取的一种酚类抗氧化物质，具有抗炎、抗脂质过氧化、清除自由基、保护肝脏及抗肿瘤等作用。其机制与激活Nrf2-ARE信号通路，诱导Ⅱ相解毒酶和抗氧化物酶类，增强机体内源性抗氧化能力有关。

我们研究团队通过整体动物实验和细胞培养用不同剂量MeHg染毒及11种物质预处理，运用仪器分析、生物化学、分子生物学和电子显微镜的技术和方法，检测了大鼠大脑枕叶皮质、培养原代神经胶质细胞和神经原Hg含量，Glu、Gln含量，磷酸活化的谷氨酰胺酶（PAG）、谷氨酰胺合成酶（GS）活力，Glu转运体（GLAST、GLT-1）、NMDA受体NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2BmRNA水平和蛋白质表达，ROS、GSH、MDA含量和SOD、GSH-Px活力，Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活力和蛋白巯基、羰基含量，Nrf2、HO-1、γ -GCS、Gpx-1 mRNA水平和蛋白表达，8-OHdG，细胞内游离Ca2+浓度，神经细胞形态学和凋亡坏死等指标的变化。大鼠体内实验和体外神经胶质细胞和神经原培养实验结果均表明，在MeHg暴露所致神经毒性过程中，用非竞争性NMDA受体拮抗剂 MK-801［38-39］、MEM［40-41］、右美沙芬［42-43］和 Glu释放抑制剂利鲁唑［44-45］预处理不仅对Glu兴奋毒性有拮抗作用，而且能减轻氧化损伤；而用抗氧化剂牛磺酸［46-48］、N-乙酰半胱氨酸［49-50］和α-硫辛酸［51-53］预处理不仅对氧化损伤有拮抗作用，而且能减轻Glu兴奋毒性。实验结果也显示，在MeHg暴露所致神经毒性过程中，用植物提取物茶多酚［54-56］、原花青素［57］、莱菔硫烷［58-60］和姜黄素［60］预处理对氧化损伤有拮抗作用，同时也能减轻Glu兴奋性毒性，对MeHg神经毒性具有一定的保护作用，实验结果不仅为慢性MeHg中毒的防治提供理论依据，而且有实际应用价值。

综上所述，MeHg可致脑Glu代谢转运障碍，产生Glu兴奋性神经毒性，Glu兴奋性毒性可通过钙超载增加ROS的产生；MeHg使ROS增加，产生氧化损伤，ROS又可引起细胞外Glu浓度增高，加剧兴奋性毒性。这样形成恶性循环，Glu代谢转运障碍和氧化应激在MeHg神经毒性中存在的交互作用，最终导致MeHg中毒所致神经损害的发生与发展。该项研究对于阐明MeHg神经毒性作用的分子机制，防治MeHg中毒提供重要理论依据，并具有一定的实际应用价值。

致谢：该研究先后有徐斌、邓宇教授，王飞、刘巍、奉姝、杨天瑶4名博士研究生，辛辛、邓小强、田雅文、杨海波、魏衍刚、李乐慧、黎珊珊和李静慧8名硕士研究生，艾尼江、杜野、汪明昊、罗波、赵丹妮、赵琼蕊、毛翔和张环8名本科生以及申晟均、袁杰2名七年制医学生参加了该项课题的研究工作。