siRNA沉默染色质解旋酶DNA结合蛋白1对卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、侵袭、迁移的影响

李善华 张 薇

卵巢癌为妇科常见恶性肿瘤，发病率居妇科肿瘤中第三位，死亡率居第一位，给患者身体健康造成严重威胁[1]。该病起病隐匿，早期缺乏明显临床症状，易出现转移，患者5年内生存率不足40%[2]。探究卵巢癌的发病机制对于该病的靶向治疗具有十分积极的意义。卵巢癌的侵袭和转移涉及多因素、多基因共同参与，染色质解旋酶DNA结合蛋白-1(Chromodomain Helicase/ATP DNA Binding Protein 1-Like Gene，CHD1L)在多种肿瘤中如肝癌、结直肠癌、膀胱癌中均呈高表达[3-5]，且与癌细胞的增殖、侵袭和迁移有关，然而其在卵巢癌发生发展中的具体作用目前尚不明确。本研究通过将siRNA干扰CHD1L转染至卵巢癌细胞，观察其对卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响并分析其可能的作用机制，以期为卵巢癌的靶向治疗提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

高转移卵巢癌细胞株HO-8910PM购于中科院上海细胞生物研究所，在含有5%CO2、37℃细胞培养箱内常规培养，每隔3天进行传代培养一次，细胞培养3代后消化细胞，PBS溶液清洗，离心后保留下层细胞，备后续研究。

1.2 试剂与药品

胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)、胰蛋白酶购于杭州四季青有限公司；青霉素、链霉素购于美国Gibco公司；siRNA-CHD1L质粒购于上海吉玛公司；Lipofectamine 2000转染试剂购于美国Invitrogen公司；RNA反转录试剂盒购于美国Thermo公司；qRT-PCR检测试剂盒购于日本Takara公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、DMEM培养基购自于碧云天公司；DMSO购于美国Sigma公司；辣根过氧化物酶(Horse Radish Peroxidase，HRP)山羊抗兔IgG二抗购自于美国Amresco公司；TRIzol试剂、NF-κB、MMP-2、MMP-9一抗购自于美国R&D公司；结晶紫染液购自于北京中杉金桥生物技术有限公司；倒置显微镜购于Olympus公司；酶标仪购于美国Thermo Fisher Scientific公司；流式细胞仪购于美国Becton,Dickinson 公司；凝胶图像分析仪购于英国Alpha公司。Transwell小室购自北京优尼康生物科技有限公司(24孔，孔径3μm)；PCR扩增仪购自美国ABI公司。

1.3 实验方法

1.3.1小干扰RNA(Small Interference RNA，siRNA)的合成：从GenBank中获取人CHD1L基因序列，根据siRNA设计原则，设计靶向CHD1L的siRNA序列，同时设定阴性对照(si-NC)序列,见表1。

微循环学 杂志2019年第29卷第1期基础与实验 ▶

1.3.2细胞转染：收集对数生长期HO-8910PM细胞，用0.25%胰酶溶液消化后制备单细胞悬浮液，将细胞密度调整为1×106个/孔接种于六孔板，添加细胞培养液充分混匀后，放置在5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中过夜培养，待细胞融合度达到80%-90%时，更换无FBS培养液培养1h，参照 Lipofectamine 2000试剂盒转染，将si-NC组、si-CHD1L质粒分别转染至HO-8910PM细胞培养，命名为si-NC、si-CHD1L组，同时设定以未转染质粒的细胞作为空白对照组(对照组)，每组均设定6个重复孔，转染后添加无FBS培养基培养6—8h，随后更换为含FBS培养基，继续培养48h，收集细胞，进行后续检测。

1.3.3实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测细胞CHD1L mRNA表达：用TRIzol法提取转染后细胞总RNA，测定浓度以及纯度后，根据RNA反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，CHD1L上游引物：5’-TTG GTG GTG AAT ATG AAA GG-3’，下游引物：5’-TAA GAG TCG TTG GCG AGT-3’；GAPDH：上游引物：5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’，下游引物：5’-ATG GTG GTG AAG ACG CCA GT-3’；反应体系：TaqDNA 聚合酶1μl，上、下游引物各2μl，cDNA 1μl，缓冲液10μl，10mM dNTP 1μl，ddH2O 33μl；反应条件：预变性：95℃ 5min，变性：95℃ 30s，延伸：62℃ 15s，共35个循环，每个样本均设定3个重复。反应结束后利用2-△△Ct法对数据进行统计，以GAPDH为内参分析CHD1L mRNA相对表达量。

1.3.4CCK-8法检测细胞增殖情况：分别收集转染后细胞，将细胞浓度调整为1×104个/ml接种细胞培养板，培养24，36，48，72h后每孔内添加CCK-8试剂，继续培养2h后，收集细胞，添加150μl DMSO溶液混匀后静置5min，酶标仪检测450nm波长下各组细胞吸光度值(OD)，计算si-CHD1L对细胞生长的抑制。细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组OD/Control组OD)×100%。每个浓度设置6个复孔。

1.3.5划痕实验检测细胞迁移能力：收集细胞，将细胞浓度调整为1×104个细胞在细胞培养皿中，将细胞放置37℃、5%CO2培养箱中过夜培养后更换新鲜培养基，移液枪枪头蘸取细胞培养液在培养基表面划长约2cm的痕迹，培养48h后置于显微镜下观察细胞迁移变化。

1.3.6Transwell小室系统检测细胞迁移、侵袭：采用Transwell小室测定细胞迁移和侵袭，收集细胞后密度调整为1×105个/ml，上室中加入不含FBS的培养基并接种细胞，同时将含FBS的培养基添加至下室。37℃孵育24h后，去除在膜表面残留细胞，无水甲醇室温固定30min，添加0.1%结晶紫染液对膜染色，置于显微镜下统计细胞迁移数量。进行侵袭实验时，用Matrigel预涂上室风干，其余步骤同迁移实验。

1.3.7蛋白免疫印迹(Western Blot，WB)检测相关蛋白表达：收集转染后细胞消化后添加RIPA细胞裂解液冰上放置30min，离心后收集上清，采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，蛋白上样量统一为20μg，SDS-PAGE电泳结束后，将蛋白凝胶转移至PDVF膜上，4℃中行转膜反应，脱脂牛奶封闭后加入MMP-2、MMP-9、NF-κB一抗稀释液(1∶500)，4℃孵育过夜添加二抗稀释液，37℃孵育2h，ECL曝光显影后，以β-actin表达作为内参蛋白，置于凝胶成像系统中评估蛋白表达水平。以目的蛋白与β-actin蛋白条带灰度比值代表该指标的相对表达量。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 siRNA沉默CHD1L后CHD1L mRNA表达

各组CHD1L mRNA表达水平差异有统计学意义(F=37.281，P<0.05)。与对照组和si-NC组比较，si-CHD1L组细胞CHD1L mRNA表达降低，差异均有统计学意义(q均>10.344，P<0.05)。

表2 HO-8910PM细胞中CHD1L mRNA表达

2.2 siRNA沉默CHD1L对HO-8910PM细胞增殖能力的影响

各组各时点HO-8910PM细胞增殖抑制率差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，si-NC组各时间点细胞增殖抑制率无明显变化(q均<0.085，P>0.05)，si-CHD1L组细胞增殖抑制率较对照组和si-NC组均升高，差异均有统计学意义(q均>25.920，P<0.05)。

表3 siRNA沉默CHD1L对细胞增殖抑制率的影响

2.3 siRNA沉默CHD1L对HO-8910PM细胞迁移能力的影响

划痕实验显示，培养48h后，各组细胞划痕间距差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，si-NC组HO-8910PM细胞迁移能力无显著变化，差异无统计学意义(q=1.125，P>0.05)，si-CHD1L组HO-8910PM细胞迁移能力较对照组和si-NC组均降低，差异具有统计学意义(q均>13.680，P<0.05)，见图1、表4。

图1 划痕实验检测HO-8910PM细胞迁移能力

表4 各组HO-8910PM细胞间划痕间距的比较

2.4 siRNA沉默CHD1L对HO-8910PM细胞迁移、侵袭数量的影响

各组细胞迁移、侵袭细胞数量差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，si-NC组HO-8910PM细胞迁移、侵袭数量无显著变化，差异无统计学意义(q均<1.260，P>0.05)，si-CHD1L组HO-8910PM细胞迁移、侵袭数量降低，差异具有统计学意义(q均>8.410，P<0.05)。

图2 Transwell小室检测HO-8910PM细胞迁移、侵袭能力

表5 各组HO-8910PM细胞迁移、侵袭能力比较个，n=6)

2.5 siRNA沉默CHD1L对HO-8910PM细胞NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

各组NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，si-NC组NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表达无显著变化，差异无统计学意义(q均<1.200，P>0.05)，si-CHD1L组NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低，差异具有统计学意义(q均>12.450，P<0.05)。

图3 WB检测NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表达

表6 各组NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平比较

3 讨 论

卵巢癌患者易发生局部侵袭、淋巴结转移，使侵润组织和已发生转移的肿瘤组织难以完全清除，进而影响手术治疗效果[6]。虽然近年来卵巢癌手术治疗已取得较大完善和进步，但卵巢癌仍是威胁妇女生命健康的恶性肿瘤之一。流行病学研究显示，卵巢癌患者的5年存活率不足40%[7]。肿瘤侵袭、转移为一个多步骤、多阶段、多基因参与的复杂的生物过程,探讨卵巢癌侵袭、转移基因对阐明卵巢癌侵袭、转移的发生机制以及寻找治疗靶标具有十分重要的意义。

CHD1L位于人染色体1q21区,属于SNF2类家族,在转录、蛋白-DNA结合等方面发挥十分重要的调控作用。CHD1L为SNF2-类亚家族成员中唯一一个致癌基因[8]。Chen等[9]研究显示CHD1L长期高水平表达能够促进肿瘤细胞增殖，加速恶性肿瘤的形成。Hu等[10]研究发现CHD1L与肿瘤细胞的侵袭及转移密切相关，通过激活细胞肌动蛋白丝的形成，加速细胞上皮间质转化进程，进而促进肿瘤细胞的侵袭、迁移。Su 等[11]研究发现CHD1L蛋白在胃癌患者组织中高表达，其表达水平与远处转移呈显著正相关，且高表达者预后较差。乳腺癌患者CHD1L呈高表达，其表达与淋巴结转移密切相关，且可激活m TOR/MMP通路提高细胞的侵袭、迁移能力[12]。在小鼠的体内实验发现，抑制CHD1L表达后，肿瘤的侵袭和转移能力明显降低，小鼠生存期明显延长[13]。Ji 等在肝细胞癌中发现，过表达CHD1L可影响小鼠肝细胞癌进展，如可促进细胞增殖、粘附、迁移等[14]。本研究显示siRNA干扰CHD1L后HO-8910PM细胞增殖、侵袭、迁移能力均明显降低，提示CHD1L可能为调控卵巢癌细胞转移的重要因子。

NF-κB属于重要核转录因子，在未受到外界刺激情况下，其与抑制物结合以未激活状态存于细胞质内，在细胞受到外界刺激、损伤后，抑制物发生磷酸化且降解后，使NF-κB转移至细胞核中，调控细胞因子、黏附、趋化因子转录，进而参与肿瘤细胞的增殖、迁侵袭、转移过程[15,16]。研究显示NF-κB在卵巢癌的发生、发展中发挥重要作用。辛伐他汀可通过抑制NF-κB通路降低人高转移卵巢癌HO-8910PM细胞迁移、侵袭[17]。川楝素可通过抑制人卵巢癌细胞NF-κB和上皮型钙黏蛋白的表达，影响细胞侵袭和迁移能力[18]。本研究发现，siRNA沉默CHD1L后可明显降低NF-κB蛋白表达，提示CHD1L抑制后可能通过调控NF-κB表达，抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移能力。

MMP能够降解细胞外基质，在癌细胞的侵袭和转移过程中发挥着重要作用。范从红等人研究表明，上调卵巢癌细胞中MMP-2的表达水平可提高卵巢癌细胞的侵袭、迁移能力[19]。氯化尼替丁通过ERK信号通路抑制MMP-2/9的产生，抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭，表明MMP-2/9与卵巢癌细胞的侵袭和转移密切相关[20]。本研究发现，siRNA沉默CHD1L后细胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平明显降低，提示沉默CHD1L后可能通过降低MMP-2、MMP-9的表达水平抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭。

综上所述，siRNA沉默CHD1L后显著抑制卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、侵袭、迁移增殖，可能是通过抑制NF-κB，下调MMP-2、MMP-9相关蛋白发挥作用。然而NF-κB作为转录调控的关键因子，涉及到多种蛋白表达调控，其过程十分复杂，具体的作用机制尚需深入研究。