百令胶囊联合还原型谷胱甘肽对单侧输尿管梗阻模型大鼠肾脏纤维化的影响*

朱戈丽 喻业安 陈晚先 张艳霞 封宝红 伍 军

百令胶囊、还原型谷胱甘肽临床应用，能减轻慢性肾脏病症状、缓解病情[1,2]，但该两种药物联合应用治疗慢性肾脏病的研究报道少见。本文通过制作单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠模型，采用HE、SPA及免疫组化染色方法，观察百令胶囊与还原型谷胱甘肽联合治疗对UUO大鼠肾脏纤维化的影响及可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组治疗

清洁级SD大鼠28只，雄性，体重250—300g。随机分为假手术组(n=7)，实验大鼠只游离左侧输尿管但不结扎。UUO模型组(UUO组，n=7)，完全结扎左侧输尿管成模。百令胶囊治疗组(n=7)，本组大鼠于制模前1天至术后第9天，每日给予百令胶囊联合1.5 g/kg灌胃治疗一次，制作方法同UUO组。百令胶囊联合还原型谷胱肽组(联合治疗组，n=7)，本组大鼠于制模前1天至术后第9天，每日给予百令胶囊1.5 g/kg及还原型谷胱甘肽300 mg/kg灌胃治疗一次，制模方法同UUO组。百令胶囊购于杭州中美华东制药有限公司(国药准字Z10910036)。

1.2 UUO模型制作方法

大鼠禁食水12h后， 3%戊巴比妥钠溶液按0.5ml/100g腹腔注射麻醉；仰卧固定，去毛，消毒，于左侧腹部稍偏下切开约2cm左右切口，逐层分离腹部组织直至腹腔，以左侧髂血管为标志，寻找到跨过左侧髂血管的左侧输尿管，向上游离输尿管直至左侧肾盂。假手术组大鼠只游离输尿管不结扎，余三组大鼠均游离输尿管后使用0号丝线于左侧输尿管肾盂结合处以及向下1cm左右分别完全结扎，复位肠管，逐层缝合关闭腹腔。

1.3 检测指标和方法

治疗9天后，取术侧肾组织，于肾脏正中沿垂直肾脏长轴切取数块约1—2mm厚肾组织，10%福尔马林溶液固定后，常规取材，检测以下内容。所用主要试剂：一抗分别为TGF-β1抗体、Lollagen抗体，均购自武汉博士德生物有限公司； BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自碧云天公司；HFP标记羊抗兔二抗购自武汉博士德有限公司； ECL底物，购自Thermo公司；显影定影试剂，购自天津汉中摄影材料厂。

1.3.1肾脏组织病理观察：取10%福尔马林固定的肾组织标本常规石蜡包埋、切片，常规方法HE和PAS染色，PAS染色糖原呈红色，细胞核呈蓝色，光镜下观察各组肾小管间质病变。

1.3.2肾脏组织纤维化：取上述石蜡切片，常规方法Masson染色，染色纤维呈蓝色，光镜下观察肾脏组织纤维化。

1.3.3免疫组化染色检测I型胶原蛋白、TGF-β1和a-SMA表达：取上述石蜡切片，常规方法脱蜡，0.01M枸橼酸缓冲液进行抗原修复，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶。正常山羊血清封闭液室温封闭30min。分别滴加不同的一抗，4℃湿盒中孵育15h。滴加山羊抗兔/小鼠二抗，37℃孵育20min。最后加入DAB显色液，显微镜下控制显色时间。苏木素复染。脱水，封片。采用PBS缓冲液替代一抗作为阴性对照，阳性染色为棕色。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组肾脏组织病理学变化比较

HE和PAS染色显示：假手术组大鼠肾脏结构正常，肾小管排列整齐、紧密，肾小管基底膜光滑，间质内无炎症细胞侵染。UUO组大鼠肾小管部分上皮细胞空泡变性，部分管腔扩张，肾小管基底膜弥漫性增厚，可见间质水肿，炎性细胞浸润。百令胶囊治疗组，肾小管结构较为完整，炎性细胞浸润减少，但仍见部分肾小管管腔扩张。联合治疗组肾小管结构较完整、排列整齐，未见明显管腔扩张和炎细胞浸润。见图1、图2。

2.2 各组肾脏组织纤维化比较

Masson染色后组织纤维呈蓝色。结果显示，假手术组大鼠肾脏组织未见明显纤维化。UUO组，大鼠肾脏组织纤维化严重。百令胶囊治疗组和联合治疗组大鼠纤维化明显减轻，联合治疗组效果更明显。见图3。

2.3 各组免疫组化指标比较

2.3.1I型胶原蛋白：假手术组肾间质I型胶原蛋白阳性(棕色)染色较弱，即I型胶原蛋白表达较少。UUO组可见肾间质I型胶原蛋白呈棕色强阳性染色，即I型胶原蛋白表达增加。百令胶囊或百令胶囊联合谷胱甘肽治疗后，大鼠肾间质I型胶原蛋白阳性染色减弱， I型胶原蛋白表达减少，联合治疗组效果较百令胶囊治疗组更少。见图4。

2.3.2TGF-β1表达：假手术组TGF-β1蛋白染色不明显，UUO组可见TGF-β1蛋白强阳性(棕色)染色。百令胶囊治疗组和联合治疗组， TGF-β1蛋白阳性染色减弱，联合治疗组阳性染色更少。见图5。

2.3.3a-SMA表达：假手术组动脉平滑肌细胞中表达a-SMA，肾间质未见a-SMA表达。UUO组肾间质a-SMA蛋白阳性染色(棕色)明显，即a-SMA蛋白表达增加。百令胶囊治疗组肾间质a-SMA蛋白阳性染色减弱， a-SMA蛋白表达减少，联合治疗组较百令胶囊治疗组更少。见图6。

图1 各组大鼠肾脏组织病理学变化(HE染色，×200)

图2 各组大鼠肾脏组织病理学变化(SPA染色，×200)

图3 各组大鼠肾脏组织纤维化 (Masson染色，×200)

图4 各组大鼠肾脏组织I型胶原蛋白表达(免疫组化染色，×200)

图5 各组大鼠肾脏TGF-β1蛋白表达(免疫组化染色，×200)

图6 各组大鼠肾脏组织a-SMA蛋白表达(免疫组化染色，×200)

3 讨 论

肾脏纤维化是所有慢性肾脏病进展至终末期肾病的一种病理损伤过程。肾脏纤维化形成主要涉及以下几个环节：(1)炎性细胞浸润；(2)肾脏固有细胞损伤、活化，细胞增殖与凋亡，以及细胞表型转化；(3)促炎症因子的异常分泌；(4)细胞外基质异常积聚；(5)细胞外基质产生与降解功能失调等，造成大量细胞外基质在肾脏内沉积，导致肾小球硬化、足细胞丢失，肾小管及间质毛细血管减少，肾小管萎缩，完整的肾单位逐渐减少直至消失[3]。因此，改善肾脏纤维化是治疗慢性肾脏病的重要环节。

目前临床上常用的纯中药制剂百令胶囊(杭州中美华东制药有限公司，规格0.5g)，主要成分是D-甘露醇、虫草酸、载体生物碱、19种氨基酸、多种维生素及微量元素，具有补肺肾、益精气的作用[4]。注射用还原型谷胱甘肽(重庆药友制药有限公司，商品名：阿拓英兰，规格：0.9g/支)，活性成分为还原型谷胱甘肽,广泛分布于人类肝细胞和肾细胞,参与体内氧化还原过程,与过氧化物及自由基结合,组成机体的抗氧化系统,清除各种氧和自由基[5，6]。两者联合应用于慢性肾脏病患者，可能起到协同治疗的作用，增强两药临床治疗效果。本研究显示，UUO 大鼠发生明显肾间质纤维化病理改变。通过百令胶囊联合还原型谷胱甘肽治疗，明显改善和减轻UUO大鼠的肾小管基底膜增厚和肾脏组织纤维化。

肾间质纤维化的胶原成分主要为Ⅰ 、Ⅲ型胶原，是细胞外基质的主要组成部分，在慢性肾脏病过程中发挥重要作用[7，8]。TGF-β1是纤维化过程中的关键调节因子, 能够诱导成纤维细胞向成肌纤维细胞转分化，参与肾间质纤维化过程中的各个环节[9]。而a-SMA作为肌成纤维细胞的表面标志,正常的肾间质成纤维细胞和肾小管上皮细胞并不表达，但病理状态下，肾间质成纤维细胞和肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化，均表达a-SMA[10]。本研究通过对大鼠肾组织进行Masson检测、免疫组化检测，结果均表明百令胶囊联合还原型谷胱甘肽治疗UUO，可以阻止肾小管上皮细胞转分化，抑制a-SMA表达，减少胶原及细胞外基质合成，且效果优于百令胶囊治疗组。说明百令胶囊联合还原型谷胱甘肽，具有明显抗肾间质纤维化作用。

综上所述，百令胶囊联合还原型谷胱甘肽治疗，可能抑制I型胶原蛋白和TGF-β1蛋白高表达，减少成纤维细胞转化，从而改善肾间质纤维化。提示临床两药联用，以加强改善患者临床症状，提高对慢性肾脏病患者疗效。