异丙肾上腺素下调NADPH氧化酶负调控瘦素表达加剧db/db小鼠心功能异常

陈 鹏 王 萍

随着现代社会生产和生活方式的改变及人口老龄化的加剧，糖尿病的发生率和死亡率呈逐年升高趋势[1，2]。糖尿病心肌病是糖尿病最常见的并发症，严重威胁患者的生存状态和生活质量。糖尿病心肌病的发生与多种因素相关，如应激性刺激[3，4]，但是其确切的发病机制尚不明确。异丙肾上腺素是β受体激动剂，临床上多用于支气管哮喘和心脏房室传导阻滞。但同时，使用异丙肾上腺素可能引起心动过速、心律失常和心悸等，甚至引起心绞痛，加剧心脏损伤，但是其确切的发病机制尚不清楚。科研用2型糖尿病db/db小鼠是目前研究糖尿病发病机制及药物治疗的重要模型[5-7]。已有证据表明氧化应激与几种心肌病动物模型有关[8-10]。本研究探讨瘦素异常表达在异丙肾上腺素引起的心脏功能障碍中的作用以及NADPH氧化酶的改善作用，为相关新药开发和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂和仪器

野生型小鼠和db/db小鼠均购自上海实验动物中心；Anti-p22phox (sc-271968)、 Anti-p47phox (sc-365215)、Anti-p67phox (sc-374510)、Anti-gp91 (sc-130543)均购自Santa Cruz公司, Anti-基质金属蛋白酶(MMP)2 (ab80737)、Anti-MMP9 (ab38898)、Anti-leptin (ab3583)、Anti-TIMP1/2 (ab3625) 均购自Abcam公司，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)购自国药集团，NADPH氧化酶抑制剂apocynine购自Sigma Aldrich公司(粉末，纯度≥98%，采用生理盐水配置成100mg/ml实验浓度)。脱色摇床及转膜仪购自北京六一仪器厂；样品保存箱和超低温冰箱为海尔集团产品；垂直电泳仪及凝胶成像仪购自美国BioRad公司。所有操作均符合实验动物管理条例的要求。

1.2 动物分组及处理

db/db小鼠和野生型小鼠均随机分为3组：对照组、异丙肾上腺素组和NADPH氧化酶抑制剂apocynin组(n均=6)。异丙肾上腺素组和apocynin组小鼠给予异丙肾上腺素(1mg/kg)皮下注射，连续6天，对照组小鼠给予等量生理盐水注射。apocynin组小鼠从第4天起给予apocynin (100mg/kg)灌胃治疗，对照组和异丙肾上腺素组小鼠给予等剂量的CMC-Na (100mg/kg)灌胃。6天后检测以下指标。

1.3 小鼠心功能指标检测

主要计算左心室重量指数，连续测出3个心搏舒张末左室内径、舒张末室间隔厚度、左室后壁厚度，得出平均值，然后采用Deiereux的心室重量校正公式校正左心室重量，再进一步计算左心室重量指数。

1.4 Western Blotting检测NADPH 氧化酶亚基、瘦素及MMP和TIMP1/2蛋白表达

小鼠腹腔注射20%乌拉坦(0.5ml/100g)进行麻醉，脱臼处死并分离心脏组织。提取小鼠左心室总蛋白，采用考马斯亮蓝法进行总蛋白的定量。在各个点样孔中以等量蛋白进行10%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和半干法进行转膜。然后将醋酸纤维素膜用5.0%的脱脂牛奶封闭1h。纤维素膜封闭后与一抗4℃杂交过夜，无菌PBS漂洗3次后与辣根过氧化酶标记二抗室温反应后进行显色、拍照。用凝胶成像分析系统测定光密度，以β-actin为内参进行蛋白的相对定量分析。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 apocynine改善异丙肾上腺素引起的左心室异常

不论是野生型小鼠还是db/db型小鼠，多组间左心室重量指数差异均有统计学意义(F=32.545，46.587，P<0.01)，与同型小鼠对照组比较，异丙肾上腺素组小鼠左心室重量指数均明显升高(t=1.435，2.433，P<0.01)，而apocynine组较异丙肾上腺组明显改善(t=2.453,2.067，P<0.05)，见图1。

注：与对照组比较，*P< 0.01；与异丙肾上腺组比较，#P< 0.01；与同组野生型小鼠比较，△P<0.05

2.2 apocynine改善异丙肾上腺素引起瘦素蛋白的异常表达

不论是野生型小鼠还是db/db小鼠，多组间瘦素蛋白的表达差异均有统计学意义(F=32.765，49.023，P<0.01)，与同型对照组小鼠比较，异丙肾上腺素引起野生型和db/db型小鼠瘦素表达显著降低(t>4.435，P<0.01)，而apocynin组小鼠上述异常明显恢复(P<0.01)，见图2。

注：与对照组比较，*P< 0.01；与异丙肾上腺组比较，#P< 0.01；与同组野生型小鼠比较，△P<0.05

2.3 apocynine改善异丙肾上腺素引起的NADPH 氧化酶亚基异常表达

不论是野生型小鼠还是db/db型小鼠，多组间NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phoox、p67phox和 gp91差异均有统计学意义(F均>29.753，P<0.01)。与对照组比较，异丙肾上腺素组小鼠NADPH 氧化酶亚基p22phox、p47phoox、p67phox和 gp91表达显著升高(t均>2.234，P<0.01)，而apocynine组较异丙肾上腺组明显改善(t均>2.450,P<0.01)，见图3。

注：与对照组比较，*P<0.01；与异丙肾上腺组比较，#P<0.01；与同组野生型小鼠比较，△P<0.05

2.4 apocynine改善异丙肾上腺素引起的MMP异常表达

不论是野生型小鼠还是db/db型小鼠，多组间MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2表达差异均有统计学意义(F均>34.341，P<0.01)。与对照组比较，异丙肾上腺素组小鼠MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2表达显著升高(t均>3.398，P<0.01)，而apocynine组较异丙肾上腺组明显改善(t均>4.185，P<0.01)，见图4。

注：与对照组比较，*P<0.01；与异丙肾上腺组比较，#P<0.01；与同组野生型小鼠比较，△P<0.01

3 讨 论

糖尿病心肌病是糖尿病最常见的大血管并发症之一，严重威胁着患者的生存状态。但目前关于糖尿病心肌病的发病机制尚不明确。β受体的激活参与了心律失常的恶化及心脏功能的异常过程。本研究发现异丙肾上腺素组小鼠存在明显的心功能异常，且NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox及瘦素表达明显升高，MMP2/9和TIMP1/2也明显升高，且db/db小鼠变化比野生型小鼠变化明显，表明异丙肾上腺素通过下调NADPH氧化酶负调控的瘦素表达加剧db/db小鼠心肌功能异常。

以往的研究发现MMPs及其抑制剂调控了心肌纤维化及糖尿病并发症和心律失常的病理过程[11，12]。MMPs的异常表达导致了心脏结构的异常和心肌细胞内电信号转导的异常[13，14]。本研究中也证实了MMPs和TIMPs蛋白表达的异常是异丙肾上腺素引起心肌细胞损伤的重要机制。胶原的积聚过程和MMP表达的升高与多种因素相关[15-17]。氧化应激过程是细胞内最常见的病理及生理过程，且与多种疾病的发病密切相关，如糖尿病、心肌病等。本研究也发现异丙肾上腺素能够引起NADPH 氧化酶亚基表达的显著增强，而apocynine可以有效缓解上述异常，提示NADPH氧化酶调控的氧化应激也与此过程有关。

基于上述结果，本研究推断异丙肾上腺素恶化db/db小鼠的心功能的过程中NADPH氧化酶发挥着关键的作用，而apocynine是NADPH氧化酶的特异性抑制剂，能够直接与NADPH氧化酶结合而发挥作用，本研究中apocynine为阳性对照药物，其可以通过抑制NADPH氧化酶改善小鼠心功能异常。在多种心肌病病理模型中，MMP及其抑制剂调控的细胞外基质重构发挥着重要的作用[18，19]。以往的研究发现细胞外基质的降解与重构是心脏、肾脏等器官发生组织纤维化的重要诱因[20，21]。本研究也证实与对照组比较，异丙肾上腺素组小鼠心功能存在明显的异常，且NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox及瘦素表达明显升高，MMP2/9和TIMP1/2也明显升高。

综上所述，本文通过分析推测异丙肾上腺素通过下调NADPH氧化酶负调控的瘦素表达加剧db/db小鼠心肌功能异常，其具体机制有待进一步研究。