α-平滑肌肌动蛋白表达在进展期结直肠癌化疗疗效预测及预后中的意义

谷俊杰，孙 昭，赵 林，白春梅

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院肿瘤内科，北京 100730

结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤。在中国，结直肠癌在男性和女性最常见癌症中分别居第4位和第3位，男性和女性结直肠癌的发病率分别为10.13%和9.25%[1]。早期结直肠癌可通过手术切除治愈，但约60%以上结直肠癌患者在诊断时即为Ⅲ/Ⅳ期，其中80%～90%患者为不可切除的转移性结直肠癌。化疗是治疗晚期结直肠癌的基本治疗手段，一线化疗方案为奥沙利铂联合氟尿嘧啶方案(FOLFOX、XELOX、SOX)，有效率40%～50%，转移性结直肠癌患者中接受化疗的中位生存期为20个月左右，不治疗的患者中位生存期仅为5～6个月。

肿瘤是一种难以愈合的慢性损伤，其生物学行为并不完全由肿瘤细胞本身决定。肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)包括肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、大量炎症细胞、免疫细胞和炎症因子[2- 3]，可在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)是TME中的重要组成部分，可影响肿瘤的生物学行为和预后。CAFs是肿瘤基质中活化的成纤维细胞，主要表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein，FAP)和波形蛋白等[4]。CAFs可通过自分泌或旁分泌的方式分泌多种炎症因子，如白细胞介素- 6(interleukin- 6，IL- 6)、环氧化酶- 2(cyclooxygenase- 2，COX- 2)、C-X-C结构域趋化因子配体12(C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12)和缺氧诱导因子- 1α(hypoxia-inducible factor- 1α，HIF- 1α)[2，5- 6]，与肿瘤细胞对化疗药物耐药相关。研究显示，CAFs可分泌IL- 6，活化JAK2/STAT3信号通路，促进转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)介导的上皮间质转化，抑制卵巢癌细胞凋亡，导致卵巢癌细胞对紫杉醇耐药[3]。CAFs也可上调金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase- 1，MMP- 1)的表达，降低头颈部鳞状细胞癌对头孢菌素的敏感性[7]。而结直肠癌中CAFs与传统化疗药物的关系尚未明确。Samuel等[8]研究发现，在接受化疗(奥沙利铂联合氟尿嘧啶)的结直肠癌细胞系中分别加入正常结肠成纤维细胞分泌的条件培养液(normal colonic fibroblasts conditioned medium，CM-NCF)或肿瘤相关成纤维细胞分泌的条件培养液(carcinoma-associated fibroblasts conditioned medium，CM-CAF)，后者药物剂量效应曲线远远好于前者，提示了CAFs对结直肠癌细胞有保护作用。而将化疗(奥沙利铂联合氟尿嘧啶)中的结直肠癌细胞系与CAF共培养时，发现CAFs可以通过PI3KCA/AKT/mTOR/Survivin及JAK2/STAT3途径诱导肿瘤细胞阻滞在G0或G1期，从而利于肿瘤细胞修复受损DNA以及帮助肿瘤细胞准确进行有丝分裂，减少化疗药物对肿瘤细胞的杀伤，导致耐药。但是目前研究主要停留在分子生物及细胞生物水平，在结直肠癌患者中尚未报道过CAFs和原发耐药的相关性。本研究拟在结直肠癌患者的临床标本中验证CAFs与结直肠癌患者对奥沙利铂联合氟尿嘧啶化疗疗效及预后的相关性。

材料和方法

标本来源及分组2013年6月至2017年2月在北京协和医院就诊的结直肠癌患者。纳入标准：(1)组织病理证实为进展期结直肠癌；(2)有完整的影像学检查可供肿瘤分期评价；(3)有足够的组织标本可供免疫组织化学检测；(4)接受奥沙利铂联合氟尿嘧啶化疗(FOLFOX、XELOX、SOX)；(5)通过实体瘤疗效评价标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST)进行疗效评价。排除标准：(1)缺乏足够的组织标本供免疫组织化学检测；(2)化疗疗效评价为病情稳定(stable disease，SD)。将患者分为以下两组：(1)化疗耐药组：Ⅳ期结直肠癌患者接受一线化疗后首次病情评估为病情进展(progressive disease，PD)或Ⅲ期结直肠癌患者术后辅助化疗结束后6个月内复发；(2)化疗敏感组：局部晚期结直肠癌患者在接受一线化疗后出现病情缓解(partial response，PR)或完全缓解(complete response，CR)。

临床资料采集采集并记录患者的临床资料，包括年龄、性别、病理类型、分化程度、肿瘤分期、病变部位、化疗期间的影像学资料。

免疫组织化学检测手术切除的组织标本或穿刺活检组织标本经甲醛固定、常规石蜡包埋，制成4 μm厚切片。采用免疫组织化学方法检测α-SMA蛋白的表达情况。其中，一抗为鼠抗人α-SMA抗体(塞维尔生物GB13044，中国)，浓度为1∶1000；二抗为山羊抗鼠通用抗体(DAKO K5007)，采用PBS代替一抗作为阴性对照，按照试剂说明书操作。

结果判读所有石蜡切片免疫组织化学检测结果由2名病理科医师(不清楚患者临床资料)独立阅片，如果结论不一致，则由第3位病理科医师独立评估并做最终决定。α-SMA蛋白表达于CAFs的细胞浆，细胞浆染为棕黄色为阳性细胞。通过染色强度及阳性细胞百分比共同判断阴阳性。染色强度计分方法：无 0分，淡棕色 1分，深棕色 2分；随机选择5个高倍视野，计算阳性细胞百分数的平均值：阳性细胞<10% 0分，阳性细胞10%～40% 1分，阳性细胞 40%～70% 2分，阳性细胞 >70% 3分。α-SMA低表达指总计分 0～2分，高表达指总计分 3～5分(图1)。

统计学处理采用SPSS 24.0统计软件，α-SMA蛋白表达与临床特征及化疗疗效间的关系采用χ2检验，α-SMA蛋白表达与无进展生存时间的关系采用Kaplan-Meier法并绘制生存曲线；采用双侧概率检验，取α=0.05为显著性检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

患者临床特征共52例进展期结直肠癌患者入组，其中，男30例，女22例，中位年龄52岁；高分化者5例(9.6%)，中分化者37例(71.2%)，低分化者7例(13.5%)，未分化者3例(5.8%)；左半结肠癌40例(76.9%)，右半结肠癌11例(21.2%)，左右半结肠癌1例(1.9%)；化疗敏感组30例，化疗耐药组22例。

α-SMA蛋白表达水平与临床病理特征的关系52例患者中，29例(55.8%)为α-SMA高表达，α-SMA蛋白的表达与患者的年龄(χ2=0.113，P=0.730)、性别(χ2=0.515，P=0.332)、肿瘤部位(χ2=3.675，P=0.159)、组织分化程度(χ2=1.852，P=0.604)均无显著相关性(表1)。

α-SMA蛋白表达与化疗疗效的关系52例患者中，29例α-SMA高表达，化疗耐药19例(65.5%，19/29)；23例α-SMA低表达，化疗耐药3例(13.0%，3/23)；α-SMA高表达者化疗耐药率显著高于低表达者(χ2=14.470，P=0.000)(表1)。

α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白

α-SMA：α-smooth muscle actin

A.α-SMA低表达；B. α-SMA高表达

A. low α-SMA expression；B. high α-SMA expression

图1癌症相关成纤维细胞中α-SMA免疫组织化学染色结果(×40)

Fig1Immunohistochemical staining for α-SMA expression in carcinoma-associated fibroblasts(×40)

表1 52例进展期结肠癌患者α-SMA表达与其临床病理特征及化疗疗效间的关系Table 1 Relationship between α-SMA expression and clinicopathological characteristics and chemotherapy response in 52 patients with advanced colorectal cancer

α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白

α-SMA：α-smooth muscle actin

图2无进展生存的Kaplan-Meier生存分析曲线

Fig2Kaplan-Meier curves for progression-free survival

讨 论

奥沙利铂联合氟尿嘧啶方案是晚期结直肠癌的一线化疗方案。奥沙利铂和氟尿嘧啶均是通过抑制DNA合成产生细胞毒作用和抗肿瘤活性。奥沙利铂通过产生水化衍生物作用于DNA，形成链内和链间交联，从而抑制DNA的合成，而氟尿嘧啶类药物是胸苷酸合成酶抑制剂，通过阻止脱氧尿苷酸(dUMP)甲基化转变为脱氧胸苷酸(dTMP)，从而影响DNA的合成。奥沙利铂联合氟尿嘧啶的原发性耐药机制有多种原因，包括基因突变、表达耐药相关蛋白和形成免疫抑制性TME等。

根据“种子和土壤”假说，肿瘤基质(土壤)对肿瘤细胞(种子)的发生和发展至关重要[9]。CAFs是肿瘤基质中活化的成纤维细胞，主要来源于正常的成纤维细胞、内皮细胞、脂肪干细胞、上皮细胞及骨髓干细胞。CAFs形态呈纺锤形，胞体较大，富含弹力纤维，与肌成纤维细胞相似，其表达的生物标记物主要有α-SMA、FAP、波形蛋白、人S100钙结合蛋白A4(human S100 calcium binding protein A4，S100A4)和平足蛋白(podoplanin，PDPN)[10]。大量文献显示CAFs可促进肿瘤组织内皮细胞增生，血管新生，促进肿瘤生长、侵袭，但少有文献报道CAFs与结肠癌化疗耐药及预后间的关系。Mesker等[11]认为丰富的肿瘤基质与肿瘤不良预后密切相关。Tsujino等[12]也发现α-SMA高表达的结直肠癌患者无病生存期较α-SMA低表达的患者短。Mercedes等[13]探讨了CAFs的标记物α-SMA、成纤维细胞特异蛋白(fibroblast specific protein，FSP1)、FAP及M2型巨噬细胞的标记物CD163与结直肠癌患者预后间的关系，结果发现α-SMA、FSP1、FAP及CD163高表达的患者，其总生存期和无病生存期较短，提示CAFs和M2型巨噬细胞与结肠癌不良预后相关。Choi等[14]探讨了α-SMA、S100A4和PDPN与结直肠癌预后的关系，发现PDPN(-)/α-SMA(高)或PDPN(-)/S100A4(高)的患者预后不佳。本研究以α-SMA表达标记CAFs，探索了α-SMA表达与进展期结直肠癌化疗疗效及预后间的关系，结果发现α-SMA高表达的患者更易出现奥沙利铂联合氟尿嘧啶类药物的原发耐药，且无进展生存期更短，提示CAFs可能成为潜在的结直肠癌治疗靶点。

综上，本研究结果显示，α-SMA表达在进展期结直肠癌中具有重要意义，与其对化疗原发耐药相关，可作为预测进展期结直肠癌化疗疗效的分子标志物。近年来，靶向治疗广泛应用于临床，成为肿瘤治疗研究的新热点，CAFs可能成为潜在的肿瘤治疗的靶点。