8-烯丙基山竹醇在口腔鳞癌化学预防中的作用

董海涛，曹 菁，韩超明，宿 颖，张辛燕，陈 新

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院口腔科，北京 1007302常州大学制药与生命科学学院，江苏常州 2131643首都医科大学附属北京口腔医院口腔医学研究所，北京 100050

山竹醇又名多聚异戊二烯基苯甲酮[1]，是从印度藤黄的干果皮中提取出来的一种黄色晶体化合物[2]。山竹醇对口腔癌有明显的化学预防作用，是一个很有前途的天然化学预防制剂[1，3]。有研究显示，山竹醇结构中C(8)位置上的过大支链可能会阻碍山竹醇与相应活性位点的结合，导致山竹醇抗癌活性降低，膜渗透性变差[4- 5]。因此，本课题组与常州大学合作，对山竹醇的C(8)位置进行结构改造，用烯丙基代替过大的5-甲基- 2-(1-甲基乙烯基)- 4-己烯基支链，合成山竹醇新衍生物8-烯丙基山竹醇[6]。本研究通过对比8-烯丙基山竹醇与山竹醇对人口腔鳞癌细胞系CAL27生物学行为的影响及对对二甲基苯并蒽(7，12-dimethylbenz[a]anthracene，DMBA)诱导的地鼠口腔颊囊异常增生的抑制作用，初步评估了8-烯丙基山竹醇对口腔癌的化学预防作用。

材料和方法

细胞学实验

主要试剂与设备：山竹醇(美国北卡农工大学桑圣民教授提取并惠赠)，8-烯丙基山竹醇(常州大学制药和生命科学院陈新教授合成并惠赠)，四甲基偶氮唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)(美国Sigma 公司)，胎牛血清(澳大利亚LonZa公司)，DMEM：高糖培养基、青-链霉素、0.25% 胰酶(美国Hyclone 公司)，Annexin V-FITC/PI 双染试剂盒、流式细胞仪(美国BD 公司)，离心机、恒温培养箱(北京五洲东方科技发展有限公司)，SPECTRAmax酶标仪(美国 Molecular Devices公司)，IX71型OLYMPUS倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。

细胞株和细胞培养：将人口腔鳞状细胞癌细胞株CAL27(北京口腔医学研究所提供)置于含10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml 链霉素的 DMEM：高糖培养基(Hyclone，USA)中，37 ℃、5% CO2孵箱内培养，选用对数生长期细胞进行实验。

MTT法检测细胞增殖：将对数生长期的CAL27 细胞悬液调整浓度至3×104/ml后，接种到6块96孔培养板，每孔200 μl，细胞贴壁后按0、5、10、20、40、60 μmol/L的浓度梯度向96 孔板中加入0.5 mmol/L山竹醇或8-烯丙基山竹醇混悬液，每个浓度设6 个复孔，同时设置不加细胞的调零孔和不加药物的阴性对照孔。在37 ℃、5% CO2的孵箱中分别孵育24、48、72 h，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续培养4 h后终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入200 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪波长OD 490 nm处测量各孔的吸光值。

克隆形成实验：将对数生长期CAL27细胞用0.25%胰酶消化成单细胞悬液，将500个细胞接种于60 mm细胞培养皿中，细胞贴壁后，按10、20 μmol/L的浓度梯度加入0.5 mmol/L山竹醇或8-烯丙基山竹醇混悬液，每个浓度设3个样本，同时设置阴性对照组。连续培养3 d后，换液处理，每皿加培养基3 ml，继续培养8 d后终止培养，固定后姬姆萨染色，相机拍照，裸眼计数细胞集落，计算克隆形成率。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。

划痕实验：先用标记笔在6孔板背后用直尺均匀画横线，大约每隔0.5～1.0 cm 1道，横穿过孔。在6孔板中接种CAL27细胞，掌握过夜即可铺满。第2天用枪头(200 μl)垂直于背后的横线划痕。用无菌PBS液洗细胞3次，换成无血清的培养基。按10、20 μmol/L的浓度梯度加入0.5 mmol/L 山竹醇或8-烯丙基山竹醇混悬液，每个浓度设3 个样本，同时设置阴性对照组。细胞培养0、12、24 h后分别拍照。计算相对迁移率。

Annexin V-FITC/PI 双染色法检测细胞凋亡：将对数生长期的CAL27 细胞接种于60 mm细胞培养皿，于37 ℃、5% CO2恒温箱内孵育过夜，按10、20 μmol/L的浓度梯度加入0.5 mmol/L 山竹醇或8-烯丙基山竹醇混悬液，每个浓度设3 个样本，同时设置阴性对照组。孵育24 h后收集细胞，采用Annexin V-FITC/PI 双染试剂盒进行染色，方法参照说明书，流式细胞仪检测细胞凋亡。

动物实验

实验动物和试剂：雄性叙利亚金黄地鼠，7～8 周龄，体质量100～120 g，购自维通利华实验动物公司。DMBA、5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine，BrdU)及鼠抗鼠BrdU单克隆抗体(美国Sigma公司)，甘油、丙酮(北京化学试剂公司)，10%中性福尔马林缓冲固定液、免疫组织化学载玻片(北京益利公司)，PBS缓冲液、胃酶、DAB显色液(福州迈新公司)。0.5% DMBA溶液配制：0.5 g DMBA溶于25 ml丙酮溶液中，再加入75 ml石蜡油中，置于棕色瓶中避光保存，摇匀后使用。8-烯丙基山竹醇和山竹醇混悬液配制：8-烯丙基山竹醇和山竹醇加入少量DMSO溶解后，加甘油定容分别得到0.5和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇和山竹醇溶液，-20 ℃保存，摇匀后使用。

动物模型建立：34只叙利亚金黄地鼠分笼饲养，常规饲养1 周后开始实验。4 只不涂药作为阴性对照，其余30 只于金黄地鼠左侧颊囊涂0.5% DMBA，每周一、三、五共涂3 次，涂3 周。3 周末将DMBA金黄地鼠随机分为5 组，每组6只，阳性对照组不涂药，其余4 组分别于地鼠左侧颊囊涂0.5、1.0 mmol/L 山竹醇或8-烯丙基山竹醇溶液，每周3 次，涂2 周。第5 周末实验结束断髓法处死全部动物，处死前2 h腹腔注射50 mg/kg的BrdU。完整取左侧口腔颊囊黏膜组织，固定在10%的福尔马林溶液中，用于HE染色和免疫组织化学染色。实验期间，每周称量1次体质量，并做记录。肉眼观察地鼠颊囊黏膜变化情况。动物维护遵循全国营养学会和医学会的指导原则，并经北京口腔医院动物伦理委员会的批准(KQYY- 201708- 004)。

组织病理学观察：将福尔马林固定的颊囊组织卷成筒状，分切为5～6 mm宽条状，常规石蜡包埋、切片，HE染色。切片于北京协和医院病理科应用日本HAMAMATSU公司NDP(NanoZoomer DigitalPathology)系统扫描全切片图像，采用NDP.view 2浏览软件标记单纯增生和异常增生范围，计算出相应面积。记数每只动物口腔黏膜上皮单纯增生、异常增生的面积，计算每组动物每种病变的面积平均数。组织学诊断由两位高年资病理医生盲读进行。

BrdU染色检测细胞增殖：组织切片采用免疫组织化学Envision二步法BrdU染色。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知金黄地鼠阳性切片作为阳性对照。结果判定：细胞核染成棕黄色的为阳性细胞。计数方法：每张切片随机选取3 个以上不同视野，200 倍显微镜下计数每个视野的阳性细胞个数作为增殖指数，以代表细胞增殖活跃程度。

统计学处理采用SPSS 17.0统计软件，数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析；用药组间两两比较采用LSD检验，两两比较的P值均经过Bonferroni校正；P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

细胞学实验结果

8-烯丙基山竹醇对CAL27 细胞增殖的抑制作用强于山竹醇：与阴性对照相比，山竹醇及8-烯丙基山竹醇均可抑制CAL27细胞的增殖，且呈一定浓度和时间依赖关系。药物作用72 h，8-烯丙基山竹醇的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)为(13.13±2.55)μmol/L，明显低于山竹醇的(32.20±3.24)μmol/L(t=8.008，P=0.001)；两种药物同种浓度作用效果相比较，8-烯丙基山竹醇对细胞增殖的抑制作用明显强于山竹醇，以10(24 h：t=8.012，P=0.001；48 h：t=5.939，P=0.001；72 h：t=12.551，P=0.001)和20 μmol/L(24 h：t=8.887，P=0.001；48 h：t=9.324，P=0.002；72 h：t=5.361，P=0.002)浓度时差异最为显著(表1)，因此后续的实验均选择10、20 μmol/L两种浓度进行。

表1 山竹醇和8-烯丙基山竹醇对CAL27细胞增殖抑制作用的比较(n=6,-±s)Table 1 Comparison of inhibitory effects on CAL27 cells proliferation between garcinol and 8-allyl garcinol(n=6,-±s)

与0 μmol/L比较，aP<0.05，bP<0.01

aP<0.05，bP<0.01 compared with 0 μmol/L

8-烯丙基山竹醇对CAL27 细胞的克隆形成抑制强于山竹醇：肉眼观察可见，与阴性对照组相比，山竹醇及8-烯丙基山竹醇用药组CAL27 细胞菌落形成数减少，细胞集落也变小。其中，山竹醇和8-烯丙基山竹醇用药组20 μmol/L浓度时的克隆形成率分别为(44.1±0.4)%和(23.6±0.6)%，明显低于10 μmol/L浓度时(55.6±2.8)%(t=6.894，P=0.019)和(31.0±0.6)%(t=15.556，P=0.001)；10(t=14.682，P=0.003)和20 μmol/L(t=51.514，P=0.001)浓度时8-烯丙基山竹醇对CAL27 细胞菌落形成的抑制作用明显强于山竹醇。

8-烯丙基山竹醇对CAL27 细胞迁移能力的抑制作用弱于山竹醇：划痕实验结果显示，用药12 h时，10和20 μmol/L山竹醇组的细胞相对迁移率分别为(16.00±4.55)%(t=3.139，P=0.026)和(3.00±3.16)%(t=6.608，P=0.001)，均明显低于阴性对照组的(30.33±7.64)%；10和20 μmol/L 8-烯丙基山竹醇组的细胞相对迁移率分别为(16.25±3.86)%(t=3.245，P=0.023)和(6.00±2.65)%(t=5.214，P=0.006)，也均明显低于阴性对照组的(30.33±7.64)%。用药24 h时，10和20 μmol/L山竹醇组的细胞相对迁移率分别为(23.75±4.57)%(t=4.718，P=0.005)和(5.75±1.50)%(t=10.432，P=0.001)，均明显低于阴性对照组的(45.33±7.64)%；10和20 μmol/L 8-烯丙基山竹醇组的细胞相对迁移率分别为(23.50±2.38)%(t=5.529，P=0.003)和(11.67±2.31)%(t=7.308，P=0.002)，也均明显低于阴性对照组的(45.33±7.64)%。在10 μmol/L浓度下，山竹醇组和8-烯丙基山竹醇抑制作用相似(12 h：t=0.084，P=0.936；24 h：t=0.097，P=0.926)；20 μmol/L浓度作用24 h时，山竹醇组的相对迁移率显著低于8-烯丙基山竹醇(t=4.151，P=0.009)。

8-烯丙基山竹醇对CAL27 细胞凋亡的促进作用弱于山竹醇：凋亡实验结果显示，10 μmol/L时，山竹醇组的早期凋亡率为(5.00±0.10)%，明显高于阴性对照组的(1.57±0.21)%(t=25.750，P=0.001)；晚期凋亡率为(0.23±0.06)%，与阴性对照组的(0.03±0.06)%差异有统计学意义(t=4.243，P=0.013)；8-烯丙基山竹醇组的早期和晚期凋亡率分别为(3.03±0.50)%和(0.27±0.06)%，与阴性对照组的(1.57±0.21)%(t=4.932，P=0.051)和(0.03±0.06)%(t=4.950,P=0.090)差异均无统计学意义。20 μmol/L时，山竹醇组的早期和晚期凋亡率分别为(5.90±0.78)%(t=39.384，P=0.001)和(9.73±1.67)%(t=10.101，P=0.001)，均明显高于阴性对照组；8-烯丙基山竹醇组的早期和晚期凋亡率分别为(4.63±1.16)%(t=4.511，P=0.041)和(0.93±0.23)%(t=6.548，P=0.017)，均明显高于阴性对照组。同种浓度作用效果相比较，8-烯丙基山竹醇对细胞凋亡的促进作用明显弱于山竹醇(10 μmol/L：t=5.982，P=0.004；20 μmol/L：t=8.578，P=0.001)(图1)。

动物实验结果

体质量观察：自实验起始至结束，各组地鼠体质量均呈持续增长态势，阴性对照组、阳性对照组、0.5 mmol/L 山竹醇处理组、0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组、1.0 mmol/L 山竹醇处理组和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组地鼠的体质量分别为(171.0±11.9)、(165.7±13.6)、(167.0±8.7)、(161.5±21.7)、(166.7±17.2)和(158.3±7.4)g，差异无统计学意义(F=0.503，P=0.771)。

颊囊肉眼观察：正常金黄地鼠颊囊黏膜菲薄、有弹性，黏膜下血管清晰可见。0.5% DMBA处理3周后，颊囊表现为黏膜充血、糜烂，大量黏稠脓液分泌；第 5 周末可见阳性对照组颊囊增厚，表面粗糙、充血，局部仍可见溃疡。用药组颊囊变薄，厚度接近正常，充血减轻。

组织病理学观察：光镜下显示正常地鼠颊囊黏膜上皮为角化的复层鳞状上皮，约4～6层细胞；单纯增生表现为细胞数目的增多，组织结构清晰，上皮粒层明显，棘层增生，没有非典型细胞；异常增生表现为上皮结构异常，如过角化、粒层明显、棘层增厚、基底细胞复层、核着色深、胞核胞质比例增大、核分裂相增多等(图 2)。

阳性对照组、0.5 mmol/L 山竹醇处理组、0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组、1.0 mmol/L 山竹醇处理组和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组地鼠口腔黏膜上皮单纯增生面积分别为(1.27±0.23)、(0.86±0.30)、(0.73±0.25)、(0.74±0.11)和(0.64±0.12)mm2，其中，0.5 mmol/L 山竹醇处理组(t=2.546，P=0.031)、0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组(t=3.485，P=0.008)、1.0 mmol/L 山竹醇处理组(t=4.556，P=0.001)和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组(t=5.393，P=0.001)均明显低于阳性对照组，各用药组间差异无统计学意义(F=0.915，P=0.457)。阳性对照组、0.5 mmol/L 山竹醇处理组、0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组、1.0 mmol/L 山竹醇处理组和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组地鼠口腔黏膜上皮异常增生面积分别为(1.26±0.36)、(0.97±0.15)、(0.82±0.23)、(0.71±0.15)和(0.56±0.11)mm2，其中，0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组(t=2.130，P=0.046)、1.0 mmol/L 山竹醇处理组(t=3.434，P=0.010)和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组(t=4.518，P=0.004)均明显低于阳性对照组，1.0 mmol/L 山竹醇处理组(t=2.793，P=0.023)和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组(t=4.997，P=0.001)均明显低于0.5 mmol/L 山竹醇处理组。

图1山竹醇及8-烯丙基山竹醇各浓度组的CAL27细胞凋亡散点图

Fig1Apoptosis dispersion map of CAL27 cells after treatment with different concentrations of garcinol or 8-allyl garcinol

图2正常地鼠颊囊黏膜上皮、单纯增生上皮及异常增生上皮结构(HE)

Fig2Different structure of normal mucosal epithelium，hyperplasia epithelium，and dysplasia epithelium of hamster cheek pouch(HE)

BrdU免疫组织化学染色结果：各组均可见棕黄色BrdU阳性细胞(图3)。阴性对照组、阳性对照组、0.5 mmol/L 山竹醇处理组、0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组、1.0 mmol/L 山竹醇处理组和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组地鼠的BrdU增殖指数分别为5.40±0.97、17.53±3.75、13.05±0.66、10.70±1.11、9.54±0.75和9.82±1.32，其中，阴性对照组(t=7.563，P=0.001)、0.5 mmol/L 山竹醇处理组(t=2.862，P=0.029)、0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组(t=4.693，P=0.002)、1.0 mmol/L 山竹醇处理组(t=5.071，P=0.002)和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组(t=5.133，P=0.001)均明显低于阳性对照组，0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组(t=3.724，P=0.007)、1.0 mmol/L 山竹醇处理组(t=7.000，P=0.001)和1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组(t=4.413，P=0.003)均明显低于0.5 mmol/L 山竹醇处理组。

A、A’.阴性对照组；B、B’.阳性对照组；C、C’.0.5 mmol/L 山竹醇处理组；D、D’.0.5 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组；E、E’.1.0 mmol/L山竹醇处理组；F、F’.1.0 mmol/L 8-烯丙基山竹醇处理组

A,A’.negative control；B,B’.positive control；C,C’.0.5 mmol/L garcinol treatment group；D,D’.0.5 mmol/L 8-allyl garcinol treatment group；E,E’.1.0 mmol/L garcinol treatment group；F,F’.1.0 mmol/L 8-allyl garcinol treatment group

图3BrdU免疫组织化学染色

Fig3BrdU immunohistochemistry

讨 论

流行病学及大量动物实验已经证明，人类食物中的很多天然成份都具有杰出的预防癌症的作用[7]。山竹醇作为从印度藤黄干果皮中提取的一种活性酚类复合物，具有抗炎、抗癌等多种生物活性[8- 12]。本研究结果也表明，山竹醇能够抑制人口腔鳞癌细胞CAL27的增殖、克隆形成及迁移，促进口腔鳞癌细胞的凋亡。

本课题组以往研究证实，山竹醇可通过抑制5-脂氧化酶(5-lipoxygenase，5-LOX)，对DMBA诱导的地鼠口腔颊囊急性炎症和颊囊的口腔鳞状细胞癌有化学预防作用[4]。而山竹醇结构中C(8)位置上的过大支链可能会阻碍山竹醇与5-LOX 的活性位点相结合。计算机建模也表明，过大C(8)侧链可能影响山竹醇的生物活性，因此本课题组设计用较小的基团取代过大的C(8)侧链，来提高山竹醇的膜渗透性及生物活性。本课题以往曾将C(8)位置的庞大侧链用1个小得多的甲基基团来取代，合成了8-甲基山竹醇[5]。然而研究发现，8-甲基山竹醇的抗癌活性弱于山竹醇，提示甲基为山竹醇 C(8)位置的非活性基团，C(8)侧链可能是山竹醇的重要活性部位，改变C(8)侧链会影响山竹醇的抑制作用[5]。而理想的山竹醇新活性衍生物应能够提高其吸收和渗透性能，但并不影响其生物活性。应以其活性基团的结构为基础，对其进行结构改造，设计新的衍生物，提高化合物的活性。因此，本课题组对山竹醇的C(8)位置进行结构再改造，用烯丙基代替过大的5-甲基- 2-(1-甲基乙烯基)- 4-己烯基支链，合成山竹醇的新衍生物8-烯丙基山竹醇[6]。

本研究结果表明，8-烯丙基山竹醇对细胞增殖及细胞克隆形成的抑制作用明显优于山竹醇，推测其原因可能是由于8-烯丙基山竹醇 C(8)侧链的减小，提高了其膜渗透性及生物利用度，从而更好地发挥作用，同时提示烯丙基可能有助于抑制肿瘤细胞的增殖。Li等[3]通过建立小鼠头颈部肿瘤模型研究发现，用山竹醇处理后小鼠肿瘤中的Ki- 67、CD31等增殖指标下降，表明山竹醇可以在体内抑制肿瘤细胞的增殖。本研究结果也显示，药物处理组的地鼠BrdU增殖指数均较阳性对照组显著降低，8-烯丙基山竹醇抑制口腔上皮细胞增殖和异常增生的效果明显优于山竹醇，与体外细胞实验一致。此外本研究还发现，8-烯丙基山竹醇对细胞迁移能力的抑制作用和促进细胞凋亡效果较山竹醇弱，提示山竹醇中的烯丙基不能完全替代C(8)侧链的过大支链，改变C(8)侧链可能影响凋亡信号通路的表达。

综上，本研究结果显示，8-烯丙基山竹醇抑制口腔上皮细胞增殖和异常增生的效果明显优于山竹醇，但对细胞迁移能力的抑制作用和促进细胞凋亡效果较山竹醇弱，提示改变C(8)侧链将影响山竹醇对口腔鳞癌细胞的生物学作用。后续研究将建立口腔鳞癌动物模型，进一步探讨8-烯丙基山竹醇对口腔鳞癌的作用及具体机制，为进一步研究山竹醇的结构—活性关系提供理论基础。